张玉洁， 朱 苹， 孙怡琳， 郏雁飞， 马晓丽*

(1.潍坊医学院 临床检验诊断学系, 山东 潍坊 261053； 2.西北农林科技大学 理学院, 陕西 杨凌 712100； 3.山东第一医科大学附属中心医院 基础医学研究中心, 山东 济南 250013)

0 引言

吸烟是诱发肺癌发生、发展的重要环境因素之一，烟草中主要成瘾成分尼古丁通过激活细胞表面尼古丁乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)影响细胞增殖、粘附和迁移等功能[1-3].nAChR是配体门控通道超家族成员之一，由两种亚单位(α1-10，β1-4)构成的同源或异源性五聚体[4-6]，全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)研究结果表明，位于人15号染色体上编码α3、α5和β4亚基的CHRNA3/A5/B4基因簇为尼古丁依赖相关的基因，异源性五聚体α5-nAChR的编码基因胆碱能受体烟碱α5亚基(cholinergic receptor nicotinic alpha 5 subunit,CHRNA5)与吸烟相关性肺癌的发生密切相关[7, 8]，它的功能多态性与尼古丁依赖和肺癌风险相关，可能是人群中吸烟相关疾病风险的遗传标记[9-11].其中编码α5-nAChR的CHRNA5基因突变和肺癌发生尤为相关[12, 13]，但α5-nAChR蛋白在肺鳞癌中的表达情况及其与临床病理参数的相关性尚未见报道.

本研究通过Oncomine和TCGA数据库分析CHRNA5在肺鳞癌中的表达及其与临床病理特征的相关性，再利用免疫组化方法检测α5-nAChR在临床肺鳞癌患者组织样本和癌旁组织中的表达情况，分析其与吸烟史之间的相关性，以探究CHRNA5在吸烟相关性肺鳞癌的表达及临床诊断意义.

1 材料与方法

1.1 材料

肺癌肿瘤组织芯片购自上海芯超生物技术有限公司，芯片型号为No.OD-CT-RsLug04-004，包含来自于52例肿瘤病人的肺鳞癌组织及癌旁组织，患者年龄39～78岁，平均年龄62岁，其中男性30例，女性22例，具有吸烟史22例，没有吸烟史30例，51例病理分级为Ⅰ-Ⅱ级，1例为Ⅱ-Ⅲ级，本实验病理学参数根据世界卫生组织(WHO)的标准所判定.α5-nAchR兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司，免疫组织化学染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司.

1.2 方法

1.2.1 利用Oncomine 数据库提取数据

Oncomine数据库是一个基因芯片的数据库和整合数据挖掘平台，根据需要设定筛选和挖掘数据的条件.本研究设置的数据提取条件为：①“Gene: CHRNA5”；②“Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis”；③“Cancer Type: Lung cancer”；④“Data Type: mRNA”；⑤临界值设定条件(Pvalue<0.05， fold change>2，gene rank=Top 10%) .P<0.05表示差异有统计学意义.

1.2.2 利用TCGA 数据库下载数据

通过TCGA(http://tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/)数据库，利用R2.15.3 软件Epicalc 函数包下载并预处理肺鳞癌数据集TCGA-LUSC-HiSeqV2数据的mRNA表达，保留TCGA数据集中包含临床参数的病例，并根据表达谱数据，对样本的CHRNA5表达进行排序，取其中位数上下定义为高表达组和低表达组，通过结合年龄、性别、病例分期、吸烟史等临床数据进行相关性分析.

1.2.3 免疫组织化学

用二甲苯脱去包埋在组织芯片上的石蜡，梯度乙醇脱水，然后用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复，在室温下用0.3%的双氧水孵育15分钟以去除内源性的过氧化物酶活性，组织芯片再用山羊血清孵育30分钟进行封闭，随后用α5-nAchR一抗(稀释度1∶500)对组织芯片进行4 ℃ 孵育过夜，用生物素二抗室温进行孵育15分钟，然后用辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育15分钟，随后用DAB进行染色，再利用苏木素进行复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片.

1.2.4 结果判定标准

采用半定量积分法，对每个视野下的阳性细胞率和阳性细胞着色强度分别进行分级评分，根据两项得分的乘积确定其阳性强度.染色强度：阴性(无着色)0分，弱阳性(淡黄色细颗粒)1分，中等阳性(棕黄色颗粒)2分，强阳性(褐黄色颗粒)3分；染色面积：0～5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%以上为3分.采用积分综合计量：免疫组化评分=染色强度评分×染色范围评分.随机选取5个高倍镜视野(×200)，按以上评分标准评分，取平均值为最后得分，<4者为阴性，>4者为阳性.所有切片均由2名有经验的病理科医师采用双盲法评估算分.

1.2.5 统计学分析

数据分析采用SPSS 17.0软件完成，定量数据应用mean±SD表示，组间比较采用t检验；定性数据采用率表示，组间采用χ2检验；P<0.05为存在统计学差异.

2 结果与讨论

2.1 CHRNA5 在临床常见肿瘤中的表达

截止到2019年8月，Oncomine数据库共收录402个关于CHRNA5 基因表达水平的相关研究，其中癌组织和正常组织间存在显著差异表达的有27个数据集，13个数据集显示CHRNA5在癌组织中高表达，14个数据集在癌组织中低表达(如图1所示).

图1 基于Oncomine 数据库分析CHRNA5在临床常见肿瘤中的表达情况

2.2 CHRNA5在肺肿瘤和肺鳞癌中的表达

通过对Oncomine数据挖掘，发现有7个mRNA芯片数据集对比分析了肺癌组织与正常组织中CHRNA5基因的差异表达(如图2所示)，其中有4个芯片数据(包括514个样本)提示了肺癌组织中CHRNA5表达水平显著升高.分别是Beer Lung、Hou Lung、Selamat Lung和Stearman Lung.

其中，有两个Oncomine数据库为CHRNA5在肺鳞癌数据集中的表达情况(如图3所示)，CHRNA5在肺鳞癌中的表达量均高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)[9].分别是Hou Lung和TCGA Lung2.

2.3 TCGA数据库分析CHRNA5在肺鳞癌中的表达与临床病理学特征的相关性

通过对491例TCGA数据集中肺鳞癌RNA-SEQ数据结合相关病理学特征进行分析，其中男364例，女127例，年龄39～90岁，中位年龄为67岁，结果显示，CHRNA5表达上调和TNM分期(P>0.05)无关，与年龄(P=0.048)、性别(P=0.01)、吸烟史(P=0.01)以及吸烟量(P=0.037)相关性显著(如表1所示).

图2 Oncomine 数据库分析CHRNA5在肺癌组织中与正常肺组织中的表达

(a)CHRNA5在Hou Lung数据库中的表达

(b)CHRNA5在TCGA Lung2数据库中的表达图3 Oncomine基因芯片数据库分析CHRNA5在肺鳞癌中的表达

表1 CHRNA5与肺鳞癌患者临床病理参数相关性分析

注：N表示肺癌患者的样本数

2.4 α5-nAchR在临床肺鳞癌组织中的表达

免疫组织化学结果显示，α5-nAchR主要表达于细胞膜以及细胞质，呈现大小不一的棕黄色颗粒，且在肺鳞癌组织及癌旁组织中都有表达，但表达量有差异(图4(a)、(b)).在癌旁组织中α5-nAchR的染色较弱，而肺鳞癌组织中α5-nAchR染色较强.

(a)癌旁组织 (b)肺鳞癌组织

(c)有吸烟史的肺鳞癌组织 (d)无吸烟史的肺鳞癌样本图4 α5-nAchR在肺鳞癌中的表达(200×)

52例肺鳞癌组织中，27例(27/52，51.9%)癌组织存在不同程度的α5-nAchR的表达水平升高，而在癌旁组织中，α5-nAchR蛋白阳性表达率为28.8%(15/52)(如表2所示)，提示在肺鳞癌组织中，α5-nAchR蛋白表达水平高于癌旁组织(P=0.027).

表2 α5-nAchR在肺鳞癌和癌旁组织中的表达

结合吸烟史分析发现，在有吸烟史的肺鳞癌组织标本中，肺鳞癌患者组织标本α5-nAchR在细胞质和细胞膜染色较深，而在无吸烟史患者的组织标本中，α5-nAchR在细胞质和细胞膜染色较浅(图4(c) 、 (d))，且在23例有吸烟史标本中，18例(18/23，69.6%)患者α5-nAchR高表达(如表3所示)，结果显示α5-nAchR在有吸烟史的肺鳞癌患者组织中的阳性表达率明显高于非吸烟患者肺鳞癌组织(P=0.029).

表3 α5-nAchR表达与肺鳞癌患者吸烟史的关系

3 结论

吸烟是诱发肺鳞癌发生、发展的重要环境因素，烟草中最重要的成瘾成分，尼古丁可以通过结合并激活尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)，促进癌细胞的增殖，侵袭和迁移[14-16].已有研究证明，α5-nAChR对肺腺癌细胞的增殖、HIF-1α以及VEGF等蛋白的表达有影响[17, 18]，且α5-nAChR蛋白高表达和肺腺癌患者吸烟史、生存率存在相关性[19-21]，尼古丁还能通过α5-nAChR的表达激活JAK/STAT3、Jab1/STAT3进一步参与调节肺腺癌细胞的增殖、侵袭与上皮间质转化[22-24]，以上研究对象皆为肺腺癌，α5-nAChR在肺鳞癌中表达情况以及和临床病理特征之间关系仍未见报道.

Oncomine数据库是一个涵盖多种肿瘤样本的数据库，包含基因差异表达分析、临床相关性分析等多种功能.本研究先通过Oncomine数据库分析CHRNA5在肺鳞癌中的差异表达，并结合免疫组织化学方法分析了α5-nAChR蛋白在肺鳞癌芯片样本中的表达，证明CHRNA5在肺鳞癌中表达及临床意义，提示CHRNA5作为生物标记物具有识别吸烟者疾病风险升高的潜力.CHRNA5可能为吸烟相关性肺癌发生、发展的客观参考指标，为肺癌的研究和治疗提供了新的思路.本研究今后拟进一步扩大样本例数，并对患者进行随访，探讨CHRNA5与肺鳞癌患者预后生存期关系及临床意义，为CHRNA5成为肺癌治疗的靶点之一提供实验依据.