刘玉杰， 高 岩， 刘洪达

(河北省唐山市第二医院 足踝外科， 河北 唐山 063000 )

0 引言

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种退行性关节病，主要特征为关节软骨逐渐丧失，软骨基质破坏，软骨下骨硬化，导致骨赘形成[1].OA的发生是由多种因素共同作用的结果，包括衰老、超负荷应急、氧化应激等，从而改变了关节生理和生物力学环境的变化.研究证实，某些蛋白酶和凋亡因子可诱导软骨基质降解和软骨细胞凋亡，是OA发生的重要因素[2,3].年龄相关的氧化应激被认为是OA发生发展的主要原因[4,5]，H2O2是由超氧岐化酶形成的超氧化合物，可以产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，从而导致细胞和动物线粒体的凋亡.主要原理为H2O2改变线粒体膜，使细胞小体C进入到细胞质中[6]，参与caspase-3活化，是细胞凋亡信号通路的调节因素，最终导致细胞的凋亡.

自噬是细胞凋亡的另一种自毁过程，是细胞存活的重要途径[7].越来越多的研究证实，细胞的自噬保护功能一部分是通过负调控凋亡发挥的作用.花青素是黄酮类化合物的一个重要亚科，在花、果、种子和植物叶片中含量丰富.研究证实，花青素具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗诱变的特性[8].本研究使用大鼠软骨细胞凋亡模型，探讨花青素对H2O2诱导的大鼠软骨细胞凋亡和自噬的影响.

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

新生1周龄的SPF级SD大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；花青素、CCK8、DMSO均购自美国sigma-aldrich公司，所有抗体GADPH、Bax、Bcl-2、Beclin-1、p62均购自美国cell signaling technology(CST)公司；RNA提取试剂为Trizol和real-time PCR试剂盒，购自美国Thermo Fisher公司；反转录试剂盒，购自日本Takara公司； DMEM、胰酶、双抗、小牛血清、PBS，均购自美国Gibco公司；细胞凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD公司；酶标仪，购自美国Thermo Fisher公司.

1.2 大鼠软骨细胞的分离、培养

无菌条件下取5只SD大鼠的软骨，切碎后用0.25%的胰酶消化后，离心，预冷的PBS洗涤三次.加入0.2%的胶原酶Ⅱ 37 ℃消化4～5 h.离心后加入10%小牛血清、1%双抗的DMEM-F12培养基吹打混匀，用200μm目筛网收集细胞.放入75 cm2培养瓶中，5% CO237 ℃孵育，作为F1代进行培养、实验.

1.3 不同浓度H2O2对大鼠软骨细胞活性检测

将F1代大鼠软骨细胞配置成1×105/mL单细胞悬液接种到96孔板内，每孔100μL细胞待细胞贴壁后，加入无血清的DMEM培养液饥饿诱导细胞24 h，每6个孔为一组，分别加入浓度为0、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L的H2O2处理6 h.随后每孔细胞加入10μL的CCK8试剂37 ℃孵育30 min，酶标仪检测450 nm波长处的吸光度.

1.4 花青素对H2O2诱导的大鼠软骨细胞活力影响的检测

将F1代大鼠软骨细胞配置成1×105/mL单细胞悬液接种到96孔板内，每孔100μL细胞待细胞贴壁后，加入无血清的DMEM培养液饥饿诱导细胞24 h，每6个孔为一组，分别加入0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL培养24 h后，在后六组均加入400μmol/L的H2O2培养6 h，每孔加入10μL的CCK8试剂37 ℃孵育30 min，酶标仪检测450 nm波长处的吸光度.

1.5 花青素对H2O2诱导的大鼠软骨细胞凋亡影响的检测

将F1代大鼠软骨细胞接种于6孔板内，待细胞贴壁后，分为空白对照组(细胞未经任何处理)，H2O2组(400μmol/L H2O2处理大鼠软骨细胞6h)、花青素+H2O2组(终浓度300μg/mL的花青素处理大鼠软骨细胞24 h后，用400μmol/L H2O2处理6 h)，胰酶消化后，离心弃上清，PBS洗涤，以每1×105个细胞加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min，上机前5 min，加入5μL的PI染色.

1.6 花青素对H2O2诱导的大鼠软骨细胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62 mRNA表达的real-time PCR检测

按照1.5中三组细胞处理后，预冷PBS洗涤3次，1 mL的Trizol消化裂解进行总RNA的提取，然后进行反转录RNA，进行real-time PCR检测.引物序列如表1所示.

表1 引物序列

1.7 花青素对H2O2诱导的大鼠软骨细胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62蛋白表达的western blot检测

按照1.5中三组细胞处理后，预冷PBS洗涤3次，RIPA裂解并提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，总蛋白与5 x SDS-PAGE loading buffer混合，100 ℃变性10 min.每孔上样30μg变性蛋白，电泳、转膜、封闭，加入一抗(Bax、Bcl-2、Beclin-1、p62均1∶1 000稀释和GADPH 1∶5 000稀释)进行封闭，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加1∶10 000稀释的HRP标记的二抗，温室孵育1 h，以上抗体均为鼠源性抗体，TBST洗涤3次.使用BIO-RAD凝胶成像仪检测，利用光密度软件Quantity One分析，以目的蛋白与内参GADPH蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量.

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0进行分析，各组CCK8吸光度和凋亡比例，Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62 mRNA和蛋白表达的数据采用单因素方差分析和Tukey的多重比较方法，组间差异有统计学意义，P<0.05.

2 结果与讨论

2.1 不同浓度H2O2对大鼠软骨细胞活性的影响

如图1所示，给予H2O2处理大鼠软骨细胞6 h后，CCK8的检测结果显示，细胞生存率明显低于空白对照组.给予200μmol/L的H2O2处理细胞后，细胞的生存能力与空白对照组没有差异，但400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L四组生存率均明显降低，与空白对照组有统计学意义，P<0.05，但400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L、1 000μmol/L四组之间没有明显差异，所以本文选用400μmol/L的H2O2剂量作为模型进行下面的实验.

图1 不同浓度H2O2处理细胞的比较(*：与空白组比较，P<0.05)

2.2 不同浓度的花青素对H2O2处理细胞的影响

花青素是一种分布广泛的多酚类[9]，是天然色素，属于生物类黄酮，是强效的抗氧化剂，可以清除ROS.研究表明，花青素特别是3-糖苷在细胞中具有较强的氧自由基吸收能力.各种报道证实花青素可以在多种细胞系中起到抗氧化压力的保护效果[10-12].刘国安等[13]通过实验证实，花青素对H2O2诱导的星形胶质细胞氧化损伤致死具有抑制作用，加入200μg/mL花青素可显著提高经H2O2处理的星形胶质细胞存活率.本实验亦证实(如图2所示)，大鼠的软骨细胞采用不同浓度的花青素(0、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL)处理24 h，后6组加入400μmol/L的H2O2处理6 h，可以看到300μg/mL、400μg/mL组细胞损伤要明显轻于400μmol/L的H2O2处理组，所以，本文选用花青素300μg/mL作为花青素+400μmol/L的H2O2进行实验.

图2 不同浓度的花青素对H2O2处理细胞的比较(*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05)

2.3 各组大鼠软骨细胞中凋亡的比较

细胞凋亡是指细胞程序性死亡，它对维持细胞的平衡发挥着重要作用，凋亡过程同时受到抗凋亡和促凋亡效应分子的调节.本研究结果显示(如图3所示)，与空白对照组相对较，H2O2组和花青素+H2O2组的凋亡比例要明显升高，但H2O2组与花青素+ H2O2组两组比较，花青素+ H2O2组的细胞凋亡比例明显较H2O2比例下降，P<0.05.提示花青素抑制H2O2处理后的大鼠软骨细胞凋亡.

C：空白对照组；H：H2O2组；AN+H：花青素+H2O2组图3 各组大鼠软骨细胞中凋亡细胞比例的比较(*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05)

2.4 各组大鼠软骨细胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62的mRNA表达的比较

如图4所示，在mRNA水平上，与空白组比较，H2O2组的Bax和p62的表达升高，Beclin-1和Bcl-2的表达下降；与H2O2组比较，花青素+ H2O2组中Bax和p62表达下降，Beclin-1和Bcl-2表达升高，P<0.05.

(a)三组实验中，Bax的mRNA表达量比较

(b)三组实验中，Bcl-2的mRNA表达量比较

(c)三组实验中，Beclin-1的mRNA表达量比较

(d)三组实验中，p62的mRNA表达量比较图4 各组大鼠软骨细胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62的mRNA表达(C：空白对照组；H：H2O2组；AN+H：花青素+H2O2组;*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05)

2.5 各组大鼠软骨细胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62蛋白表达的比较

如图5所示，在蛋白水平上，与空白组比较，H2O2组的Bax和p62的表达升高，Beclin-1和Bcl-2的表达下降；与H2O2组比较，花青素+H2O2组中Bax和p62表达下降，Beclin-1和Bcl-2表达升高，P<0.05.

(a)三组实验中，各蛋白表达情况

(b)三组实验中，Bax相对蛋白表达量比较

(c)三组实验中，Bcl-2相对蛋白表达量比较

(d)三组实验中，Beclin-1相对蛋白表达量比较

(e)三组实验中，p62相对蛋白表达量比较图5 各组大鼠软骨细胞中Bax、Bcl-2、Beclin-1和p62蛋白表达(C：空白对照组；H：H2O2组；AN+H：花青素+H2O2组;*：与空白组比较，P<0.05；#：与H2O2组比较，P<0.05 )

Bax和Bcl-2的协同平衡表达是维持线粒体完整和抑制线粒体凋亡途径的关键因素[14].Bcl-2的降低和Bax的增加可导致MMP的丧失，从而活化caspase-3.在本研究中，给予花青素的前处理可以改变由H2O2导致的Bax表达的升高和Bcl-2表达的下降，从而减少了细胞的凋亡，可以推测花青素通过抑制线粒体相关的固有途径从而起到了抗凋亡的效果.在之后的研究中，还会针对花青素对于MMP和caspase-3进行研究，验证推测的正确性.

自噬是维持细胞内平衡的重要机制，主要调节细胞的新陈代谢，能量的补给和移除损伤的细胞器.研究显示在退化的软骨细胞内功能紊乱的细胞器大量增加，从而影响细胞的正常功能.同时自噬可以降解这些损伤分子，抑制软骨细胞的凋亡，阻断关节软骨的退化和OA的进展[15-17].另外，很多研究证实，在关节软骨恶化的过程中，ROS与自噬相互作用[18,19].OA软骨细胞相较于正常的软骨细胞，其自噬水平降低，ROS水平增高[18]，在OA软骨细胞中，氧化压力抑制自噬相关蛋白的表达，促进凋亡[20].Beclin-1和p62是自噬溶酶体形成的关键蛋白[21]，当自噬发生时，Beclin-1的表达上升，p62的表达下降.本研究也证实：当H2O2作用大鼠软骨细胞时，自噬相关蛋白Beclin-1表达下降，而p62表达升高，自噬作用被抑制.当给予花青素后，可逆转H2O2对自噬的作用.

3 结论

综上所述，花青素通过活化自噬信号通路，降低促凋亡调控因子Bax和p62的表达，升高抗凋亡调控因子Beclin-1和Bcl-2表达从而逆转H2O2对大鼠软骨细胞的损伤，抑制其凋亡，减轻了由H2O2引起的氧化损伤作用.