张新草，薛项潇，姜 深，王延峰，曹永策

(延安大学 生命科学学院，陕西省红枣重点实验室，陕西延安 716000)

土壤盐碱化不仅是一个全球性的生态问题，同时是干旱和半干旱地区限制植物种子萌发、植株生长和发育的一个重要因素。全世界约有10亿hm2的土地表现出盐碱化，中国各类盐碱土地的面积为9 913万hm2，约占全国耕地面积的10%[1-2]。尤其在中国西北地区，包括宁夏、新疆、陕西和甘肃等省常年降雨较少，水分蒸发量大，土壤盐碱化严重。因此，鉴定和筛选适于盐碱地生长的植物品种(系)，具有重大的生态和经济意义。

大豆(Glycinemax)是人类主要的蛋白质和食用植物油来源，具有很高的营养价值[3-4]。中国作为世界上最大的大豆消费国，进口量逐年上升，增加国内大豆的总产量已刻不容缓[5]。充分利用中国大量的盐碱土地资源，是增加大豆产量的一个有效途径。因此鉴定不同大豆种质的耐盐碱性，对于大豆耐盐碱育种及增加大豆有效种植面积、提高大豆总产量具有重要的意义。虽然目前在大豆耐盐碱种质资源发掘方面取得许多研究进展，但仍存在一些不足之处。一是有关大豆种质的耐盐碱性鉴定侧重在耐单一的中性盐或碱性盐胁迫上，耐混合盐碱胁迫的研究较少，而混合盐碱胁迫对植物造成的危害并不是盐、碱胁迫危害的简单叠加，其危害程度要远大于单一的盐或碱胁迫[6-7]；二是大豆种质耐盐碱性的鉴定方法多种多样，不同研究者鉴定所用的指标也不尽相同[8-10]。因此，建立一种操作简单、指标明确的鉴定方法有重要意义。

种子发芽期是植株生长发育过程中的初始阶段，发芽阶段的耐盐碱性对其能否在盐碱地中存活与生长发育起到至关重要的作用[11-12]；且种子发芽期的一些形态指标(如发芽率、发芽势、根长等)因测定方法简单而被广泛应用于评价种质耐盐碱性的研究中[13-16]。为此，本试验利用18份特异的大豆种质资源，在种子发芽阶段进行混合盐碱胁迫处理，利用主成分分析、隶属函数和多元回归等统计方法对各种质的不同指标进行分析，旨在筛选出优异耐盐碱材料与重要的大豆耐盐碱性评价指标，为大豆耐盐碱育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

共选取18份大豆特异种质为试验材料(表1)。

表1 供试大豆品种(系)Table 1 Tested soybean cultivars (lines)

1.2 试验设计

釆用人工气候箱对供试的18份大豆种质进行培养，条件为光照/黑暗时间15 h/9 h，温度为28 ℃/24 ℃。挑选大小一致、子粒饱满的种子，用75%酒精消毒30 s，然后用去离子水冲洗(3～5次)干净，将种子表面水分吸干，放置于事先铺好滤纸的培养皿中(直径9 cm)，每培养皿20粒。每个培养皿加入12 mL的60 mmol/L(预试验筛选出的胁迫浓度)混合盐碱(NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3= 9∶1∶1∶9，物质的量之比)溶液，并在种子的上表面覆盖一张滤纸，每2 d更换1次培养皿内的溶液和滤纸。以蒸馏水为对照，每个处理设置3个重复。自培养第2天起，以幼苗根长度大于或等于种子长度的一半作为发芽标准，每天统计发芽数，并在处理6 d后测定其他形态指标。

1.3 指标测定

种子培养3 d后考察发芽势，培养6 d后考察发芽率，并取发芽状况较好且均匀一致的3株幼苗测量幼苗长、根长、苗鲜质量、根鲜质量和根干质量。其中：

发芽势=3 d发芽种子数/供试种子数×100%

发芽率=6 d发芽种子数/供试种子数×100%

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 21和Excel 2016数据统计分析软件对各指标值进行描述性统计和指标间的相关性分析；利用主成分分析、隶属函数和多元回归等方法对供试材料的耐混合盐碱性进行鉴定和级别归组，并筛选耐盐碱性的主要评价指标。

首先计算各个种质在各个指标上耐盐碱性测度——耐盐碱系数(Saline-alkali tolerance coefficient,SATC)：

SATCij=yij(SA)ij(CK)

其中：yij(SA)和ij(CK)分别为混合盐碱胁迫和对照条件下不同种质i(i=1,2,…,18 )在j(j=1,2,…,7)指标上观测值的平均数。

根据各指标耐盐碱系数，分析指标间相关性。分析不同耐盐碱系数间可能存在的信息交叉和重叠。

对所有耐盐碱系数进行主成分分析，以对变量进行降维。并提取累积贡献率大于85%的前P个主成分(综合指标)替代原来的耐盐碱系数用于大豆耐盐碱性评价。

计算不同材料在前P个主成分上的值，并利用隶属函数法将这些值进行标准化处理(标度到区间[0，1])。

μ(FiP)=(FiP-min(FP))/(max(FP)-min(FP))

式中：μ(FiP)表示种质i(i=1,2,…,18 )在第P个主成分(综合指标)上标准化处理后的值；FiP表示第i个种质在第P个主成分上的值；max(FP)和min(FP)分别为所有种质在第P个主成分上的最大值和最小值[17-19]。

根据主成分贡献率的大小，求出各个综合指标的权重。

式中：ωP表示第P个综合指标在所有综合指标中的权重，φP为第P个综合指标的贡献率。

根据综合指标在不同材料中的隶属函数值和各综合指标的权重，计算出18份材料耐盐碱性的综合评价值(D值)(即所有材料在各个主成分上的标准化得分的加权平均数)。

以综合D值对18份材料的耐盐碱性进行分类。标准为:(0-0.2]，极端敏盐碱；(0.2-0.4]，敏盐碱；(0.4-0.6]，中等；(0.6-0.8]，耐盐碱；(0.8-1.0]，极端耐盐碱。

最后以综合D值为因变量，各指标耐盐碱系数为自变量进行回归分析，建立回归方程。筛选出快速评价大豆种质发芽期耐盐碱性的形态指标。

2 结果与分析

2.1 发芽期指标

在60 mmol/L混合盐碱胁迫下，18份特异种质的发芽势、发芽率、幼苗长、根长、苗鲜质量、根鲜质量和根干质量的均值相较于对照组分别降低了132.9%、121.1%、97.9%、158.0%、 32.1%、161.8%和330.1%(表2)。表明混合盐碱胁迫对调查的各个指标均有负向效应，能够抑制种子发芽和幼苗的早期生长。

2.2 各单项指标的耐盐碱系数及相关性分析

由表3可知，在混合盐碱处理下，不同大豆种质的各单项指标与对照相比均有所下降，各指标的耐盐碱系数均小于1，但不同指标在种质间的变化幅度和排列顺序不同。由此可见，使用单个指标评价大豆种质的耐盐碱性，结果通常具有局限性，不够准确。

由表4可知，大豆发芽期各指标的耐盐碱系数间存在不同程度的相关性。其中，相对幼苗长与相对根长、相对幼苗长与相对苗鲜质量、相对幼苗长与相对根鲜质量、相对根长与相对苗鲜质量、相对根长与相对根鲜质量、相对苗鲜质量与相对根鲜质量、相对发芽势与相对发芽率之间存在极显著相关性(P<0.01)；相对根鲜质量与相对发芽势之间存在显著相关性(P<0.05)。各指标耐盐碱系数的相关性体现了这些指标间的内在联系，研究结果反映出不同指标所提供的信息存在着严重交叉与重叠，因此有必要对指标进行降维分析。

表2 不同处理下大豆种质发芽期各指标值的统计分析Table 2 Statisticalanalysis of indicators under different treatments of soybean at germination stage

注：SD=标准差。

Notes:SD= standard deviation.

表3 各单项指标的耐盐碱系数Table 3 Mixed saline-alkali tolerance coefficient of each indicator

表4 耐盐碱系数的相关性分析Table 4 Correlation analysis of mixed saline-alkali tolerance coefficients

注：*P<0.05；**P<0.01。

Notes：*P<0.05; **P<0.01.

2.3 耐盐碱系数的主成分分析

对大豆发芽期的幼苗长、根长、苗鲜质量、根鲜质量、根干质量、发芽势和发芽率7个指标的耐盐碱系数进行主成分分析。结果表明，上述7个单项耐盐碱系数可以转化为3个相互独立的综合指标(F1、F2和F3)。3个综合指标的贡献率分别为57.016%、19.881%和12.537%，累积贡献率达89.434%，表明这3个综合指标几乎反映了原来7个指标所代表的全部信息(表5)。

表5 主成分的特征值和累计贡献率Table 5 Eigenvalues and cumulative contribution of principal component

2.4 大豆发芽期耐盐碱性的综合评价

由F1、F2和F33个综合指标贡献率计算出各指标的权重，可知各主成分的相对重要性。结果显示3个综合指标的权重分别为0.638、0.222和0.140。根据各综合指标在不同材料中隶属函数值和指标权重的大小，计算出不同大豆种质的耐盐碱性综合评价值(D值)。结果表明，18份种质的D值为0.150到0.870，C10的D值最大，表明其耐盐碱性最强；C14的D值较小，表明其对盐碱最为敏感(表6)。最终将18份大豆种质的耐盐碱性划分为5类，其中极端耐盐碱和极端盐碱敏感的材料份数相同，均为2份，分别占总数的11.1%；中等耐盐碱的材料最多，为9份，占 总数的50.0%；耐盐碱的材料共3份，占总数 的16.7%；敏盐碱的材料共2份，占总数的 11.1%。

表6 各大豆种质发芽期耐盐碱性的综合评价Table 6 Comprehensive evaluation of saline-alkali tolerance of each soybean germplasm at germination stage

2.5 回归模型建立及鉴定指标筛选

为分析7个指标与大豆品种之间的耐盐碱性关系，筛选出能够客观鉴定大豆发芽期耐盐碱性的指标，建立可用于大豆发芽期耐盐碱性评价的数学模型。将耐盐碱性综合评价值(D值)作为因变量，把7个单项指标的耐盐碱性系数作为自变量进行逐步回归分析，建立回归方程:

D=-0.365+0.808X7+0.772X1+ 0.364X4

方程决定系数R2=0.994，P<0.001，式中X1、X4和X7分别代表幼苗长、根鲜质量和发芽率的耐盐碱系数。由此方程可知，7个参评指标中发芽率、幼苗长和根鲜质量3个指标对大豆耐盐碱性有显著性影响，在相同条件下可作为快速评价大豆种质耐盐碱性的重要指标。

3 结论与讨论

本研究基于不同指标的耐盐碱系数，利用相关性分析、主成分分析和和耐逆性综合评价D值等分析方法对18份大豆种质耐盐碱性进行评价。根据D值的大小将18份种质的耐盐碱性划分为5类，其中极端耐盐碱材料2份，分别是‘陇中黄606’和‘延豆9号’；耐盐碱材料3份，‘冀豆1708’‘晋黄10号’和‘鲁LH678’；中等耐盐碱材料9份，分别是‘宁黄29’‘泛豆G98’‘陕豆3号’‘晋科6号’‘秦豆8号’‘陕豆7号’‘中黄30’‘中品16456’和‘中作J16J270’；敏盐碱材料2份，分别是‘电白黑豆’和‘汾豆105’；极端盐碱敏感材料2份，分别是‘邯豆16’和‘石335’。研究结果可为大豆耐盐碱育种及盐碱地开发利用提供材料基础。同时本研究构建了耐盐碱性评价的回归方程，筛选出发芽率、幼苗长和根鲜质量3个指标可作为快速评价大豆种质发芽期耐盐碱性的重要指标。在相同逆境条件下，也可测定这3个指标，利用该回归方程快速预测其他种质的耐盐碱性，为大豆种质耐盐碱性鉴定及耐逆育种提供重要的 信息。

盐碱地常可分为盐地、碱地或含多种盐碱成分的混合盐碱地[20]。以往有关大豆种质耐盐碱性的鉴定研究多是基于单一的中性盐(NaCl等)或碱性盐(Na2CO3等)[8,10,12,21-22]，但前人研究结果表明，混合盐碱胁迫对植物造成的危害程度要远大于单纯中性盐或碱性盐胁迫[23-24]。因此只采用单一的中性盐或碱性盐进行胁迫试验，得到的结果对于分析大豆耐盐碱机制以及指导耐盐碱改良育种均具有一定的局限性。尤其在中国西北干旱半干旱区，土壤盐碱化严重，且盐化与碱化往往相伴发生，土壤成分中既有碱性盐，又有中性盐[25]。其中，氯化盐和碳酸氢盐是西北地区两种重要的盐碱成分[26]。因此本研究以NaCl和Na2CO3两种盐为主、Na2SO4和NaHCO3两种盐为辅混合配置混合盐碱溶液，用来模拟复杂的盐碱胁迫环境，相对单一的中性盐或碱性盐来讲，更能真实地反映田间盐碱胁迫的实际情况。

大豆种质的耐盐碱性是一个复杂性状，有时单一指标并不能全面评价其耐盐碱性。但对复杂性状使用多个指标进行评价时，又会因为性状间的相关性造成评价不准确[8，13,27-28]。本研究结果也显示了多个指标的耐盐碱系数间存在极显著或显著的相关性，且不同单项指标的耐盐碱系数在不同种质中的大小排序也有所不同，表明利用单个或多个相关的单项指标对大豆种质的耐盐碱性进行评价均具有一定局限性。因此本研究基于不同指标的耐盐碱系数，利用主成分分析和耐逆性综合评价等分析方法对18份大豆种质耐盐碱性进行了评价。在数据处理与耐性评价过程中，既降低了指标间代表信息的交叉与重叠，同时也考虑了综合指标重要性的差异，更有助于客观的评价大豆种质的耐盐碱性。并且本研究通过回归分析构建的大豆种质发芽期耐盐碱性的评价模型和筛选出的重要评价指标，在相同条件下也能够为快速预测其他种质的耐盐碱性提供依据。但在本试验中，仅对18份大豆种质发芽期耐盐碱胁迫进行了相关的试验，对种质的耐盐性和耐碱性及在其他生育期的耐盐碱性仍有待在后续工作中继续研究。