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云南植物药业有限公司，云南 昆明 650109

灯盏花素为菊科植物短葶飞蓬(Erigeronbreviscapus(Vant.) Hand. Mazz.)中提取分离得到的原料药，其是一个混合物，由野黄芩苷(灯盏花乙素)与其他成分组成，2015版《中国药典》一部灯盏花素标准中，规定含野黄芩苷不得低于90.0%(供口服用)或98.0%(供注射用)[1]，除对野黄芩苷(灯盏花乙素)有含量规定外，对其它成分没有相关限度检测。灯盏花素对心脑血管以及肝、肾、肺损伤具有保护作用。大量研究表明[2]，其保护缺血再灌注脑组织的可能机制为保护神经元与防治细胞毒性、调节血管内皮功能、缓解脑血管痉挛、改善微循环，降低血脂、调节免疫及减轻炎性反应、抗自由基损伤、抑制血小板凝集等作用。

目前，以灯盏花素为原料制成的制剂有片剂、注射剂和注射粉针剂等，临床应用较广。为了使灯盏花素原料药的物质基础和杂质成分更加清楚，对灯盏花素中野黄芩苷(灯盏花乙素)之外的成分进行分离，使灯盏花素为原料药制成的制剂产品物质基础更加清楚，为产品质量标准进一步提升及提高产品安全性打下基础。本实验从灯盏花素中进行分离，最终分离得到4个化合物，经光谱鉴定为4'-羟基黄芩素，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，4'-羟基黄芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，6-羟基山奈酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷。

1 仪器与材料

NMR测试使用Bruker DRX-500和AV-400核磁共振波谱仪；Bruker HCT Esquire 3000离子阱质谱仪；大孔吸附树脂HPD-100(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)和凝胶Sephadex LH-20，旋转蒸发仪为Buchi R210(Buchi公司)；样品检测使用GF254 TLC板(青岛海洋化工)和Waters 600高效液相色谱仪；甲醇、乙醇等均为工业纯试剂，灯盏花素由云南植物药业有限公司原料车间提供。

2 提取分离

取灯盏花素1 kg，用3倍量的水，加磷酸氢二钠溶液至完全溶解，滤过，滤液过大孔吸附树脂，依次用水，10%、20%、30%、40%和60%乙醇梯度洗脱，经液相检测合并得到10%～30%乙醇洗脱段、40%乙醇洗脱段、60%乙醇洗脱段组分，分别合并浓缩至小体积，大孔吸附树脂60%乙醇洗脱段浓缩液经反复凝胶柱层析分离，依次用水、甲醇∶水为10∶90、20∶80、30∶70，40∶60的洗脱剂梯度洗脱，40∶60洗脱段经液相检测合并相同组分，浓缩至小体积，用磷酸调pH=2，过滤，干燥，得到4'-羟基黄芩素(85 mg)；大孔吸附树脂40%乙醇洗脱段浓缩液经反复凝胶柱层析分离，依次用水、甲醇∶水为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60的洗脱剂梯度洗脱，30∶70洗脱段经液相检测合并相同组分，浓缩至小体积，用磷酸调pH=2，过滤，干燥，得到芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(124 mg)；大孔吸附树脂10%～30%乙醇洗脱段浓缩液经反复凝胶柱层析分离，依次用水、甲醇:水为10∶90、20∶80、30∶70、40∶60的洗脱剂梯度洗脱，20∶80洗脱段经液相检测合并相同组分，浓缩至小体积，用磷酸调pH=2，过滤，干燥，得到4'-羟基黄芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(37 mg)；10∶90洗脱段经液相检测合并相同组分，浓缩至小体积，用磷酸调pH=2，过滤，干燥，得到6-羟基山奈酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(47 mg)。

表1 化合物1～4的核磁共振氢谱(500 MHz)和碳谱数据(100 MHz)

No. DZH1 DZH2 DZH3 DZH4 δHδCδHδCδHδCδHδC2163.5s164.0s164.3s147.5s36.57(s)102.3D6.81(s)102.5D6.86(s)103.2D135.6s4182.0s182.4s182.0s176.2s5147.0s146.6s161.4s145.6s6129.2s130.4s6.46(D, 1.2)99.1D129.6s7153.3s151.4s162.5s151.3s86.74 (s)93.9D7.00(s)94.1D6.85(D, 1.2)94.6D6.94(s)93.1D9149.7s149.0s157.0s148.2s10104.0s105.8s105.5s105.2s1'121.5s121.3s121.0s121.8s2'7.90 (D,8.5)128.4D7.92(D, 8.3)128.5D7.95(D, 8.6)128.7D8.04(D, 8.0)129.6D3'6.90 (D,8.5)116.0D6.92(D, 8.3)116.0D6.93(D, 8.6)116.0D6.94(D, 8.0)115.5D4'161.0s161.2s161.2s159.3s5'6.90 (D,8.5)116.0D6.92(D,8.3)116.0D6.93(D,8.6)116.0D6.94(D,8.0)115.5D6'7.90(D,8.5)128.4D7.92(D,8.3)128.5D7.95(D,8.6)128.7D8.04(D,8.0)129.6D1″5.12(D,4.8)101.0D5.27(D,7.0)99.4D5.22(D,7.3)99.8D

续表1

表1 化合物1～4的核磁共振氢谱(500 MHz)和碳谱数据(100 MHz)

3 结构鉴定

化合物1 黄色粉末，溶于甲醇；ESI--MS：m/z 285[M-H]-；详细的NMR数据归属见表1，通过与文献数据仔细比对，最终确定该化合物为4'-羟基黄芩素，即4'-hydroxyscutellarin[3]。

化合物2 黄色粉末，微溶于甲醇；ESI+-MS：m/z 471[M+Na]+；详细的NMR数据归属见表1，通过与文献数据仔细比对，最终确定该化合物为4'-羟基黄芩素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，即plantagin[4-5]。

化合物3 淡黄色粉末，溶于甲醇；ESI--MS：m/z 445[M-H]-；详细的NMR数据归属见表1，通过与文献数据仔细比对，最终确定该化合物为芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(灯盏甲素)，即apigenin-7-O-β-D-glucuronide[5-6]。

化合物4 黄色粉末，微溶于甲醇；ESI--MS：m/z 477 [M-H]-；详细的NMR数据归属见表1，通过与文献数据仔细对比，最终确定该化合物为6-羟基山奈酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷，即6-hydroxykaempferol-7-O-β-D-glucuronopyranoside[7]。