许丽婷 徐彬人 盛 蒙 吴 琼 王文佳 田维毅 俞 琦

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子四味药物组成，是清热解毒最具代表的方药之一，具有泻火解毒功效，主治热毒充斥三焦之证。其临床应用非常广泛，对Ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、老年性痴呆等病症有明显疗效[1-3]。现代研究证实，黄连解毒汤可通过抗炎、降血脂、抑制血管平滑肌细胞增殖等方面发挥抗动脉粥样硬化作用[4]。但其对细胞内胆固醇含量的影响及作用机制尚不明确。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)是调控细胞胆固醇流出的有效途径，其表达不足将导致巨噬细胞内沉积大量的胆固醇，加重动脉粥样硬化病变。本研究拟采用黄连解毒汤含药血清干预泡沫细胞，观察黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞ABCA1蛋白及胆固醇含量的影响，探讨黄连解毒汤是否通过调节ABCA1蛋白表达及泡沫细胞胆固醇流出而发挥抗动脉粥样硬化作用。为其临床应用提供实验基础和科学依据。

1 材料

1.1 细胞株 小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞，购自上海中侨新舟。

1.2 药物与试剂 黄连、黄芩、黄柏、栀子购自同仁堂贵阳药店，经贵州中医药大学生药教研室鉴定为正品。胎牛血清(美国Hyclone公司)，DMEM和青链霉素混合液(美国Gibco公司)，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，广州奕源生物)，总胆固醇及游离胆固醇检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)，逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)。ABCA1和β-actin引物(上海生工生物工程)。

1.3 动物 健康SD大鼠24只，SPF级，雌雄各半，体质量(200±20)g，购自重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，许可证号: SCXK-( 军) 2012-0011。

1.4 主要仪器 SW-CJ-1F超净工作台(苏州净化)；PCR 仪(美国ABI Applied Biosystems)；ELX800全自动酶标仪(美国BioTek公司)，细胞培养箱(美国Thermo公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 制备黄连解毒汤含药血清 上述药材按传统方法进行水煎煮，煎煮两次，合并两次滤液，即得黄连解毒汤水煎剂。调整浓度为相当于生药2 g/mL，置4℃冰箱备用。SD大鼠采用随机数字表法分为正常组，黄连解毒汤大、中、小剂量组，每组6只。大、中、小剂量组分别以6、3、1.5 g生药/kg灌胃给药，体积为1 mL/100 g(大鼠体重)；正常组给予等体积蒸馏水。2 次/d，连续7 d。末次给药后股动脉采血，常规制备血清，56 ℃ 30 min 灭活补体，0.22 μm过滤除菌，-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 细胞培养及分组 细胞复苏后，用含10 %胎牛血清和1 %双抗(青霉素+链霉素)的DMEM培养基培养RAW264.7细胞，计数并调整细胞浓度，取对数生长期的细胞进行实验。以2×105个/m L的浓度接种于96孔培养板，用ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型后进行后续实验[5]。细胞分为：空白组、模型组(培养液+80 μg/mL ox-LDL)和黄连解毒汤大、中、小剂量组(20%黄连解毒汤含药血清大、中、小剂量+80 μg/mL ox-LDL)。每组设6个复孔，培养24 h。

2.3 泡沫细胞油红O染色 用PBS液洗涤各组细胞，用50%异丙醇进行固定，油红O工作液染色15 min后冲洗5 min；苏木精染色10 min，冲洗，氨水返蓝后显微镜下观察，红色颗粒为蓄积的脂质。

2.4 泡沫细胞中胆固醇含量的测定 裂解各组细胞，收集裂解细胞上清液，测定各组细胞内总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)的含量。具体按胆固醇检测试剂盒说明书操作。

2.5 RT-PCR检测细胞ABCA1 mRNA的表达 收集细胞，用Trizol提取总RNA后，紫外分光光度计测定 RNA 的浓度以及纯度。按逆转录试剂盒说明书逆转录合成 cDNA，PCR条件: 95 ℃预变性 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 40 s，扩增40个循环。ABCA1引物序列为：上游：5′-TAC CAG CAT TAA GGA CAT GCA C-3′；下游：5′-TTT GAT CCG TTA CAC AGA CTG G-3′。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析RNA，分析各组目的基因的灰度值，以目的基因与β-actin基因的比值代表ABCA1 mRNA的表达。

3 结果

3.1 黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞的影响 油红O染色显示，空白组细胞无着色，模型对照组细胞形态呈空泡样，泡沫细胞中有大量脂质蓄积。与模型组比较，黄连解毒汤含药血清小、中和大剂量组泡沫细胞内脂滴显著减少，大剂量组细胞内脂滴减少最明显(见图1)。

图1 油红O染色检测黄连解毒汤含药血清作用于泡沫细胞

3.2 黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞中胆固醇含量的影响 与空白组相比，模型组细胞内胆固醇含量明显升高(P<0.01)。与模型组比较，黄连解毒汤含药血清小、中和大剂量组细胞TC含量明显下降(P<0.05或P<0.01)；黄连解毒汤含药血清大剂量组细胞FC含量显著降低(P<0.01)，小和中大剂量组无明显差异(见表1)。

组别nTC/μmol/LFC/μmol/L空白组652.26±4.1524.38±3.65模型组6136.83±10.341)59.07±9.301)含药血清小剂量组6124.51±16.602)56.26±8.24含药血清中剂量组696.89±15.883)62.42±11.95含药血清大剂量组682.18±12.673)48.33±6.122)

注：与空白组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05，3)P<0.01。(图2同)

图2 黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞ABCA1 mRNA表达的影响

3.3 黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞ABCA1 mRNA表达水平的影响 如图2所示，与模型组比较，在黄连解毒汤含药血清的干预下，随着剂量的增加，细胞的ABCA1 基因表达明显升高(P<0.01)。

4 讨论

动脉粥样硬化是引发心血管疾病的主要原因，可导致患病人群高死亡率。动脉粥样硬化是一种由斑块堆积引起的动脉内部狭窄的疾病，其斑块的主要成分是脂肪、胆固醇、钙和血液中其他物质。在动脉粥样硬化的早期阶段，随着胞内的ox-LDL堆积、脂质负载，巨噬细胞转为泡沫细胞。病理过程中泡沫细胞凋亡，将胆固醇释放到血管中，促进动脉粥样硬化病变[11]。ABCA1是一种膜转运蛋白，激活的ABCA1可促进游离胆固醇和磷脂外流形成HDL颗粒，从而影响胆固醇从巨噬细胞的流出，因此在AS的发病机理中起重要作用[12]。中医认为动脉粥样硬化主要的三大病理因素是湿热、毒邪和痰淤。黄连解毒汤具有清热燥湿、泻火解毒之功效，主要用于治疗三焦火毒热盛的症状，可用于抵抗动脉粥样硬化的病变进程[13]。本研究通过观察黄连解毒汤含药血清对泡沫细胞的作用效果，探讨黄连解毒汤抗动脉粥样硬化的作用机制。

本实验中，与模型组比较，黄连解毒汤含药血清组泡沫细胞的油红O染色中脂滴显著减少，且大剂量组脂滴减少最明显，说明黄连解毒汤减少泡沫细胞内脂滴含量，且有剂量依赖性。与空白组相比，模型组细胞内胆固醇含量明显升高。与模型组比较，黄连解毒汤含药血清小、中和大剂量组细胞TC含量明显下降；说明黄连解毒汤可以下调泡沫细胞脂滴含量，并有剂量依赖性。黄连解毒汤含药血清大剂量组细胞FC含量显著降低，小和中大剂量组无明显差异。说明大剂量的黄连解毒汤可促进FC外排。与模型组比较，在黄连解毒汤含药血清的干预下，随着剂量的增加，泡沫细胞的ABCA1 基因表达明显升高，说明黄连解毒汤可促进ABCA1基因的表达。

综上所述，本研究发现黄连解毒汤上调泡沫细胞ABCA1的转录与表达，促进胆固醇流出，可抑制动脉粥样硬化的进展。ABCA1可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一，这对临床治疗动脉粥样硬化病变具有指导意义。