翟 璐 郭建军 桑丽雅 金仁耀* 廖 杰

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州 310012 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 浙江工商大学 杭州 310012 4 杭州南开日新生物技术有限公司 杭州 310051 5 浙江华才检测技术有限公司 浙江诸暨 311800）

随着工业化发展水平的不断提升，向环境中排放的工业污染物不断增多，重金属就是其中的重要污染物之一。由于重金属具有易富集、难降解等特性，对环境和食品质量的安全风险越来越大[1]。重金属分布广泛、难以降解，并且可以经空气、水和食物链等途径在人体中富集，当超过人体耐受极限值后容易引起严重的急慢性中毒，具有明显的致癌、致畸及致突特性，并有很强的生殖和遗传毒性[2-3]。随着人们对重金属危害认识的提升，如何有效控制重金属的危害成为目前研究的重点，特别是开展如何减少重金属的污染、提高重金属的降解和治理效果等更是研究的热点。为了摸清环境中重金属残留和降解的动态分布规律，准确评价重金属污染的危害程度，有必要加强重金属的研究，特别是开展重金属的快速、准确和高灵敏检测技术研究，可为今后开展重金属污染监控和治理提供有力的技术支撑。

当前针对重金属检测最常用的技术主要是阳极溶出伏安法（ASV）[4]、原子吸收光谱分析（AAS）[5-6]、电感耦合等离子发射光谱（ICP-AES）[7-8]、液相色谱法[9-10]和其它色谱-质谱等联用技术。虽然这些手段技术成熟，市场应用广泛，但这些分析技术也存在一些明显的不足，主要表现为分析仪器贵重，检测成本高，操作人员要求专业培训，样品前处理过程中常使用强酸、强碱等试剂，样品分析时间长，不能大批量同时检测，只能在专业实验室中分析检测等，不能满足现场的快速、大批量检测需求。免疫分析技术具有仪器简便，人员操作简单，样品前处理简单，分析时间短，可高通量现场检测，检测成本低及分析灵明度和准确率理想等优势，已成为目前最具竞争性和市场前景的检测分析技术之一，并得到广泛开发和推广应用。

国外针对重金属离子的免疫分析技术研究最早要追溯到20 世纪80 年代，如1985 年Reardan等[11]首次将重金属In3＋和EDTA 螯合物制备完全抗原，并成功制备多克隆抗体，开启了重金属免疫检测技术研究。随后国内快速兴起了采用免疫分析技术进行重金检测的研究，先后合成制备了重金属Hg2+、Pb2+、Cd2+和Pb2+的人工抗原和特异性抗体，并在此基础上建立了相应的免疫分析方法[12-16]。

重金属离子结构极其简单，且没有活性基团，只有与双功能螯合剂螯合后，再与载体蛋白连接制备的复合物才具有免疫活性，才能筛选制备相应的抗重金属抗体。从现有研究报道来看，在制备重金属离子制备人工抗原过程中涉及的双功能螯合剂主要为DTPA、EDTA 和ITCBE 等的结构衍生物[17-20]，这些螯合物在结构上属于直链开环结构，螯合剂结构中的多齿配体端与重金属离子螯合形成螯合复合物，氨基或羧基等活性基团端与载体蛋白偶联后制备人工抗原，并在此基础上制备多克隆或单克隆抗体，后续建立免疫分析方法用于重金属检测。

与所述研究报道不同，本研究选用的双功能螯合剂2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸（P-NH2-Bn-NOTA，以下简称NOTA）在结构上属于闭环结构，以重金属铅为研究对象，采用半抗原、完全抗原和多克隆抗体的制备技术，参考本实验室前期发表的论文中相关技术路线和手段[21]，通过合成重金属Pb2+人工抗原，制备兔克隆抗体，建立免疫分析方法来评价人工抗原和抗体特性，研究闭环结构双功能螯合剂在制备重金属离子抗体中的效果，为今后优化重金属离子人工抗原技术方案和完善重金属抗体制备体系提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

HRP 标记羊抗兔酶标二抗、鸡卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA），美国Sigma 公司；四甲基联苯胺（TMB）、硝酸铅水合物（99.99%）、Cu2+标准溶液、Zn2+标准溶液、Cd2+标准溶液、Fe2+铁离子标准溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、吐温-20，上海阿拉丁公司；2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸（P-NH2-Bn-NOTA），美国AREVA MED 公司；超滤离心管（Amicon Ultra-15，30KD），美国密理博公司；Bardford 蛋白浓度测定试剂盒，江苏碧云天；96 孔酶标板，广州洁特；其它试剂市售所得，均为AR 级。

1.2 仪器与设备

Fresco 21 型离心机、紫外分光度计，美国热电公司；万分之一分析天平，德国赛多利斯公司；超纯水制备仪，美国密理博公司；移液器，德国艾本德公司；自动洗板机，美国分子设备公司；电泳仪、酶标仪，美国伯乐公司。

1.3 动物实验

动物饲养、动物免疫和采血等在浙江中医药大学动物实验中心完成。

1.4 方法

1.4.1 人工抗原的合成 采用戊二醛法[21]合成免疫原Pb-NOTA-BSA。技术路线见图1。具体试验步骤如下：

配制NOTA 螯合剂溶液，称取7.5 mg NOTA，用0.01 mol/L，pH 7.4 N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）溶液2 mL 充分溶解，此反应液为A液；

配制7.5×10-2mol/L 的硝酸铅溶液，称取124.2 mg 硝酸铅，用5 mL 超纯水充分溶解，此反应液为B 液；

吸取上述配制好的硝酸铅溶液170 μL 逐滴加入到NOTA 螯合剂溶液中，室温避光缓慢搅拌4 h 后逐滴加入20 mmol/L 的戊二醛溶液600 μL，室温避光条件下搅拌反应12～14 h 为重金属螯合剂复合物；

称取30 mg BSA 溶解于3 mL HEPES 中，逐滴加入反应好的重金属螯合剂复合物，室温下避光搅拌反应24 h，反应结束后将反应液装入8 ku的透析袋，用0.01 mol/L，pH 7.4 HEPES 透析1 d。期间更换透析液4 次，然后反应液再用30 ku的超滤离心管8 000 r/min 离心4 次，后用0.01 mol/L，pH 7.4 的HEPES 溶液5 mL 充分溶解分装后置于-20 ℃保存备用。包被原Pb-NOTA-OVA的合成方法与合成步骤同上，区别在于BSA 代替OVA。

图1 铅人工抗原合成路线Fig.1 Reaction schemes of synthesis for artificial antigen of heavy metal Pb2+

1.4.2 人工抗原的鉴定 金属-螯合剂复合物及人工抗原的合成效果鉴定采用紫外扫描法和SDS-PAGE 法进行。紫外扫描方案：将Pb-NOTA、OVA、BSA、包被抗原Pb-NOTA-OVA 和免疫抗原Pb-NOTA-BSA 先在不同浓度下进行预扫描，后配制合适浓度的溶液在紫外分光光度计中测定200～400 nm 波长范围内的吸光度，根据不同波长的吸光值建立吸收曲线，通过对比最大吸收峰所在的波长数值位移变化程度来判定合成试验效果。SDS-PAGE 电泳方案：浓缩胶选择体积分数5%，浓缩胶电压75 V，分离胶选择体积分数10%，分离胶电压100 V，样品上样量为每孔10 μL，考马斯亮蓝染色1 h，在摇床上脱色4 次后，将电泳胶放入凝胶成像仪中拍照分析。

1.4.3 人工抗原结合比的测定 将制备好的人工抗原分别测定其载体蛋白浓度和重金属离子浓度，然后将测定含量转化为摩尔浓度后进行比较，即可测定出每个载体蛋白偶联的重金属离子数量。蛋白浓度采用商品化的BCA 蛋白测定试剂盒测定，Pb2+离子浓度采用电感耦合等离子质谱（ICP-MS）测定。

1.4.4 多克隆抗体的免疫 选取3 只体重为2.5 kg 左右的新西兰大白兔，以Pb-NOTA-BSA 为免疫原免疫兔子。免疫方案和免疫剂量见表1。

表1 免疫原Pb-NOTA-BSA 免疫方案Table 1 The immune protocol of immunogen Pb-NOTA-BSA

从第2 次加强免疫7 d 的兔耳静脉采1 mL血吸入EP 管中，在6 000 r/min 条件下离心10 min 后取上清10 μL 加入到2 mL 的pH 7.4，0.01 mol/L 的PBS 缓冲液中，后继续用该缓冲液进行倍比稀释抗体效价，阴性对照则选用未免疫兔子血清或初免之前采集的兔子血清，选择检测血清与阴性对照血清OD450值的比值大于2.1 所在最大稀释倍数为效价指标。当抗体效价与前次免疫检测效价值变化不明显则表明可以进行末次免疫。抗体效价测定采用ELISA 方法进行，具体步骤如下：

1）包被：pH 9.6，0.05 mol/L CBS 为包被缓冲液，包被原Pb-NOTA-OVA 质量浓度为10 μg/mL，包被量为100 μL/孔，37 ℃包被2 h，洗板4次，吸水纸上拍干；

2）封闭：每孔加入2%脱脂牛奶300 μL，置于37 ℃培养箱中反应30 min，洗板4 次，吸水纸上拍干；

3）加一抗：一抗起始浓度为200 倍稀释液，后倍比稀释11 个梯度和1 个阴性对照，每孔加100 μL，每浓度4 孔，置于37 ℃培养箱中反应1 h，洗板4 次，吸水纸上拍干；

4）加酶标二抗：每孔加入10 000 倍稀释的HRP 标记的羊抗兔二抗100 μL，37 ℃反应1 h，洗板4 次，吸水纸上拍干；

5）加底物显色：每孔加入100 μL TMB 底物缓冲液，37 ℃反应20 min；

6）加硫酸终止反应：在底物液基础上加入2 mol/L 硫酸50 μL/孔，后读取OD450值并进行计算分析。

1.4.5 多克隆抗体的提取与纯化 采血收集的抗血清按照辛酸-硫酸铵法[22]纯化，具体纯化步骤为：

1）抗血清用60 mmol/L pH 4.0 的醋酸盐缓冲溶液稀释，其血清与醋酸盐缓冲液稀释体积比为1∶4，混匀后再用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调pH 值至4.5；

2）按照每1 mL 血清滴加75 μL 辛酸的比例逐滴加入，室温下磁力搅拌反应30 min，置于4 ℃冰箱2 h，10 000 r/min 离心30 min；

3）离心后上清用定性滤纸过滤，上清用10倍体积的0.1 mol/L PBS 稀释，搅拌混匀后用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 值至7.4，置于4 ℃冰箱中30 min 预冷；

4）按照每1 mL 混合液加入0.277 g 硫酸铵比率在磁力搅拌下分批加入，加完后继续搅拌反应30 min，置于4 ℃冰箱中静置3 h，12 000 r/min 离心30 min，弃上清；

5）剩余沉淀用5～10 mL 0.01 mol/L PBS 溶解后装入8 ku 透析袋中透析以去除辛酸、硫酸铵等，透析液选用pH 7.4，0.01 mol/L 的PBS，在4℃冰箱中透析2 d，中间更换透析液4～6 次，透析完全后将透析袋内溶液分装后置于-20 ℃冷冻，冷冻干燥制备抗体冻干粉。

1.4.6 多克隆抗体的效价测定 效价测定方法与1.4.4 节所述一致，不同点在于将抗体冻干粉代替抗血清。

1.4.7 抗体标准曲线的建立 通过正交试验确定抗原抗体最佳工作浓度，采用间接竞争-ELISA 试验建立标准曲线，具体试验步骤如下：

1）包被：用pH 9.6，0.05 mol/L CBS 稀释适当浓度的包被原Pb-NOTA-OVA 后加入酶标板，每孔100 μL，置于37 ℃培养箱中反应2 h，洗板4 次后拍干；

2）封闭：每孔加入250 μL，2%脱脂牛奶封闭，置于37 ℃培养箱中反应30 min，洗板4 次后拍干；

3）样品前处理：不同浓度梯度重金属铅离子标样与5 mmol/L NOTA 按照1∶1 比例预混均匀，置于37 ℃培养箱中反应2 h；

4）加样：每孔分别加入50 μL 预混好的样品和2 倍工作浓度一抗，微量振荡器上混匀后置于37 ℃培养箱中反应1 h，洗板4 次后拍干；

5）加酶标二抗：每孔加入10 000 倍稀释的羊抗兔HRP 标记二抗100 μL，置于37 ℃培养箱中反应1 h，洗板4 次后拍干；

6）加底物显色：每孔加入100 μL TMB 底物缓冲液，置于37 ℃培养箱中反应15 min；

7）加硫酸终止反应：每孔加入2 mol/L 硫酸50 μL，读取OD450值进行计算分析。

1.4.8 抗体特异性测定 采用间接竞争-ELISA法进行交叉反应率测定。具体试验步骤与1.4.5 节所述一致，不同点在于用其它重金属离子代替铜离子进行ic-ELISA 检测，建立标准曲线，并计算IC50值，然后根据公式：CR（%）=IC50（铜离子）/IC50（待测重金属）×100，测定交叉反应率结果，评价抗体的特异性。

2 结果与分析

2.1 人工抗原合成的鉴定

根据图2 的紫外扫描结果显示，制备的包被抗原（Pb-NOTA-OVA）和免疫抗原（Pb-NOTABSA）最大吸收波长发生位移改变，初步说明载体蛋白上成功偶联上了双功能螯合剂和铅离子。

人工抗原SDS-PAGE 电泳结果如图3 所示。从图中可知，与BSA 和OVA 相比，免疫抗原（Pb-NOTA-BSA）与包被抗原（Pb-NOTA-OVA）电泳条带出现明显滞后现象，说明制备的2 种人工抗原的分子质量均分别比BSA 和OVA 大，说明一定数量的重金属螯合物连接到载体蛋白上，进一步证明偶联成功。

2.1.1 人工抗原结合比的测定 制备的人工抗原进行结合比测定，蛋白浓度测定采用Bradford 法试剂盒进行检测，重金属离子含量采用ICP-MS法进行测定，通过测定蛋白浓度和重金属离子浓度计算免疫原和包被原的结合比分别为9∶1 和7∶1，说明人工抗原合成成功。

图2 铅人工抗原紫外扫描图Fig.2 UV spectrum of Pb artificial antigen

图3 铅人工抗原的SDS-PAGE 电泳图Fig.3 The SDS-PAGE of Pb artificial antigen

2.1.2 抗体效价测定 经ic-ELISA 方法测定，免疫的3 只兔子所制备的多克隆抗体的效价从低到高分别为16 000∶1、32 000∶1 和45 000∶1，说明制备的抗原效果好，动物免疫应答强烈，制备获得理想的多克隆抗体，选用45 000∶1 效价的多克隆抗体进行后续试验。

2.1.3 标准曲线的建立 经测定，包被抗原和一抗的工作质量浓度分别为1.5 μg/mL 和2.2 μg/mL，并在此工作质量浓度下建立ic-ELISA 标准曲线（图4），经拟合曲线回归方程为y=12.127ln（x）-11.386（R2=0.9961），其IC50和IC20值分别为157.89 ng/mL 和13.30 ng/mL。

2.1.4 抗体交叉反应率测定 用间接竞争ELISA检测其它重金属离子的IC50值（表2），除了与Cd2+的交叉反应率达到12.3%外，与其它重金属离子的CR 值均低于5.3%，说明制备的抗重金属铅离子多克隆抗体的特异性较理想。

图4 间接竞争ic-ELISA 抑制率标准曲线Fig.4 Inhibition reaction of indirect competitive ELISA

3 结论

本试验以NOTA 和Pb2+为研究对象，采用戊二醛法成功制备了免疫抗原（Pb-NOTA-BSA）与包被抗原（Pb-NOTA-OVA），通过动物免疫，抗血清的采集、纯化和鉴定获得优质抗重金属铅的兔多克隆抗体，并在此基础上建立了ic-ELISA 分析方法，线性回归方程为y=12.127ln（x）-11.386（R2=0.9961），IC50和IC20分别为157.89 ng/mL 和13.30 ng/mL。除与Cd2+的CR 值达到12.3%外，与其它重金属离子的CR 值均较低，说明成功制备了抗重金属铅的多克隆抗体，试验结果为闭环结构双功能螯合剂在重金属制备抗体中的可行性提供了技术参考，为后续开展重金属离子单、多克隆抗体制备及免疫分析技术研究提供技术依据。

表2 多克隆抗体与重金属离子的交叉反应Table 2 Cross reactivity of polyclonal antibody for heavy metal ion