娄海伟 赵 玉 林俊芳 郭丽琼 赵仁勇*

（1 河南工业大学粮油食品学院 郑州 450001 2 华南农业大学食品学院 广州 510642）

蛹虫草（Cordyceps militaris）作为一种珍贵的食药两用真菌，2014 年被中华人民共和国卫生部列为新食品原料。随着蛹虫草基因组测序的完成[1]，Xia 等[2]在蛹虫草基因组中发现了虫草素和喷司他丁等抗癌活性成分的合成基因，而在冬虫夏草中未发现相关合成基因，这使得蛹虫草的市场需求量逐年增多。

类胡萝卜素是一类广泛存在于自然界的天然色素，具有抗氧化，抗肿瘤，预防心血管疾病等功效。然而，常用的类胡萝卜素都是脂溶性的，不溶于水，这极大地限制了类胡萝卜素在各领域的应用。1958 年，德国科学家Friederichsen 和Engel[3]研究发现蛹虫草中的黄色素为类胡萝卜素，而且这种黄色素是水溶性的。2013 年，Dong 等[4]从蛹虫草中分离并鉴定出4 种水溶性的新型类胡萝卜素。蛹虫草中水溶性的新型类胡萝卜素的发现，突破了脂溶性特点的限制，使得蛹虫草类胡萝卜素的市场需求量急剧上升。基于此，本文旨在筛选一种食用安全且适用于蛹虫草新型类胡萝卜素提取的溶剂和一种无环境污染的细胞破碎方法，并通过单因素试验和响应面优化，获得提取蛹虫草新型类胡萝卜素的最适工艺参数。

1 材料和方法

1.1 菌株与试剂

蛹虫草17 号菌株（CM17），华南农业大学食品学院天然产物实验室提供。

葡萄糖、MgSO4·7H2O、KH2PO4，广州化学试剂厂；维生素B1，上海源叶公司；蚕蛹粉（水溶性），Solarbio 公司；丙酮、乙醇等试剂均为分析纯级。

1.2 培养基

PDB（Potato dextrose broth）培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO43.0 g，自来水定容至1 000 mL，自然pH 值，灭菌（121 ℃，20 min）。

PDA（Potato dextrose agar）培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO43.0 g、琼脂20.0 g，自来水定容至1 000 mL，自然pH 值，灭菌（121 ℃，20 min）。

栽培培养基：大米20.0 g、葡萄糖0.6 g、蛋白胨0.1 g、蚕蛹粉0.1 g、KH2PO490 mg、MgSO4·7H2O 45 mg、维生素B10.3 mg、自来水30.0 mL，自然pH值，置于250 mL 的组培瓶中，灭菌（121 ℃，30 min）。

1.3 仪器与设备

MQD-S2R 振荡培养箱，上海旻泉公司；LRH-70 生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；GXZ智能光照培养箱，江南仪器厂；FD-1D-50 冷冻干燥机，北京博医康公司；JY92-IIN 超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物有限公司；UV-4802S 紫外可见分光光度计，优尼柯公司；5804R 高速冷冻离心机，Eppendorf 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 蛹虫草液体菌种的制备 取4 ℃斜面保藏的蛹虫草菌种CM17，接种至PDA 培养基，25 ℃培养21 d，得到活化母种。在超净台中，用接种刀从CM17 母种培养皿上取3 块1 cm×1 cm 大小的菌块接种于100 mL PDB 培养基中，25 ℃避光振荡培养（150 r/min）4 d，即得蛹虫草液体菌种。

1.4.2 蛹虫草子实体的栽培 每个已灭菌的含有栽培培养基的组培瓶中接种5 mL 蛹虫草液体菌种，20 ℃避光培养6 d，然后放入光照培养箱进行光周期培养（20 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗，光照强度500～1 000 lx），60 d 即可获得成熟的新鲜蛹虫草子实体。

1.4.3 蛹虫草子实体样品的制备 新鲜的蛹虫草子实体进行冷冻干燥，粉碎，过60 目筛备用。

1.4.4 蛹虫草新型类胡萝卜素的提取工艺 酸热法提取蛹虫草类胡萝卜素，参考邵颖等[5]的方法。超声波破碎法提取蛹虫草类胡萝卜素，参考娄海伟等[6]的方法。

1.4.5 类胡萝卜素得率的测定 蛹虫草类胡萝卜素得率的测定，参考Yang 等[7]的方法。按公式（1）计算。

式中，A——稀释后的提取液在447 nm 波长下的吸光值；V——溶剂用量，mL；D——提取液的稀释倍数；W——蛹虫草子实体干重，g。

1.4.6 提取溶剂的优化 根据前人的研究报道[4，7-8]，选取乙酸乙酯、氯仿、石油醚、乙醚、丙酮、水和乙醇作为提取溶剂，以类胡萝卜素得率为指标，旨在选取一种安全、无毒的提取溶剂。由于蛹虫草类胡萝卜素较易溶于乙醇水溶液，因此选择了50%（体积分数）乙醇作为提取溶剂。提取条件为：料液比1∶30，提取时间30 min，提取温度37℃。

1.4.7 超声波破碎法和酸热法提取类胡萝卜素分别采用超声波破碎法、酸热法[5]、无超声无酸热法（即不采用超声波破碎和酸热处理的方法；提取条件：乙醇体积分数50%、料液比1∶30、提取时间30 min、提取温度37 ℃）等3 种方法提取蛹虫草子实体中的类胡萝卜素，比较3 种提取方法的类胡萝卜素得率。

1.4.8 类胡萝卜素提取的单因素试验 以类胡萝卜素得率为指标，研究乙醇体积分数（0～100%）、料液比（1∶10～1∶100）、超声时间（0～30 min）、提取时间（0～90 min）、提取温度（4～80 ℃）、超声波功率（100～600 W）对类胡萝卜素得率的影响。

1.4.9 类胡萝卜素提取工艺的响应面优化 根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数、提取时间、提取温度为自变量（Xi），类胡萝卜素得率为响应值（Y），进行Box-Behnken 试验设计[9]。根据单因素试验设定因素水平编码表（表1）。

表1 因素水平编码表Table 1 Factors and levels of experimental design

1.5 统计分析

采用软件Origin 9.0 进行数据分析和图形制作；采用软件Desigin-expert 8.0.6 进行Box-Behnken 试验设计和分析。

2 结果与分析

2.1 蛹虫草子实体

经栽培获得的蛹虫草菌株CM17 的子实体见图1。蛹虫草作为一种新食品原料，其子实体的颜色为橙黄色，且蛹虫草黄色素已被鉴定为新型类胡萝卜素[4]，这表明蛹虫草是一种可食用的新型类胡萝卜素资源。

图1 蛹虫草CM17 的子实体Fig.1 Fruiting bodies of C.militaris CM17

2.2 提取溶剂的优化结果

图2 溶剂对蛹虫草类胡萝卜素得率的影响Fig.2 Effect of solvents on the yield of C.militaris carotenoids

不同溶剂对蛹虫草类胡萝卜素提取效果的影响见图2。由图2 可知，采用50%乙醇溶液提取蛹虫草类胡萝卜素的得率最高，显著优于水、无水乙醇的提取效果，说明乙醇水溶液更适合蛹虫草子实体中类胡萝卜素的提取，这与娄海伟等[6]的研究结果一致。其它溶剂提取蛹虫草类胡萝卜素的得率大小依次为丙酮＞水＞乙酸乙酯＞氯仿＞无水乙醇＞乙醚＞石油醚。丙酮的提取效果仅次于50%乙醇，表明丙酮也较适合蛹虫草类胡萝卜素的提取，这与Yang 等[7]、张志军等[10]、王陶等[11]的研究结果一致。相对于丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，乙醇溶液不仅提取蛹虫草类胡萝卜素的得率高，而且在食品工业中应用也较安全。因此，本文选取乙醇溶液作为蛹虫草类胡萝卜素的最适提取溶剂。

2.3 超声波破碎法和酸热法的比较结果

超声波破碎法和酸热法对蛹虫草类胡萝卜素提取效果的影响见图3。

由图3 可知，酸热法提取类胡萝卜素的得率显著高于无超声无酸热法，这是由于酸热处理能够破坏蛹虫草的细胞壁，使胞内物质（包括色素）溶出[10]。而超声波破碎法提取类胡萝卜素的得率显著高于酸热法，这表明超声波对蛹虫草细胞的破碎效果更佳。细胞破碎越彻底，原料与溶剂的接触面积越大，则类胡萝卜素的得率越高[12]。此外，超声波的空化效应能够促进溶质的溶出，并提高溶质的得率[13-14]。由于酸热法使用盐酸，基于环境保护和减少化学品污染考虑，选择了更环保的超声波破碎法提取蛹虫草类胡萝卜素。

图3 超声波破碎法和酸热法对类胡萝卜素得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic fragmentation method and thermal-acid method on the yield of C.militaris carotenoids

2.4 单因素试验结果

2.4.1 乙醇体积分数对类胡萝卜素得率的影响 乙醇体积分数对类胡萝卜素得率的影响见图4a。由图4a 可知，随着乙醇体积分数的增加，类胡萝卜素的得率先升高后降低，当乙醇体积分数为70%时，类胡萝卜素得率达到最大值，这与娄海伟等[6]的研究结果一致。因此，70%乙醇溶液较适合蛹虫草中新型类胡萝卜素的提取。

2.4.2 料液比对类胡萝卜素得率的影响 料液比对类胡萝卜素得率的影响见图4b。由图4b 可知，随着提取溶剂体积的增大，类胡萝卜素得率显著增高。当料液比达到1∶60 后，类胡萝卜素的得率趋于平缓，且无显著增加趋势，表明溶剂量已充足。这一变化趋势与赵刚等[15]的研究结果一致。因此，考虑到生产成本，选择料液比1∶60 较合适。

2.4.3 超声波破碎时间对类胡萝卜素得率的影响 超声波破碎时间对类胡萝卜素得率的影响见图4c。由图4c 可知，在0～20 min 内，类胡萝卜素得率随着破碎时间的延长而显著增加，这可能归因于细胞破碎程度的逐渐增强。当破碎时间大于20 min 后，类胡萝卜素的得率无显著增加，表明细胞已破碎完全[16]。因此，选择20 min 的超声波破碎时间较适宜。

图4 不同单因素对类胡萝卜素得率的影响Fig.4 Effects of different factors on the yield of C.militaris carotenoids

2.4.4 提取时间对类胡萝卜素得率的影响 提取时间对类胡萝卜素得率的影响见图4d。在15 min内，类胡萝卜素得率随提取时间的延长显著升高。而30 min 后，随着提取时间的延长，类胡萝卜素得率逐渐降低，这可能是由类胡萝卜素氧化导致[17]。因此，搅拌提取15～30 min 较合适。

2.4.5 提取温度对类胡萝卜素得率的影响 提取温度对类胡萝卜素得率的影响见图4e。由图4e 可知，在4～50 ℃之间，随着提取温度的升高，类胡萝卜素得率显著增加，这可能是由于温度升高，传质速率增大，从而使类胡萝卜素得率增加[18]。而当提取温度高于50 ℃时，类胡萝卜素得率显著降低，这可能是因为高温促进类胡萝卜素的氧化降解[19]。因此，提取温度选择50 ℃较适宜。

2.4.6 超声波功率对类胡萝卜素得率的影响 超声波功率对类胡萝卜素得率的影响见图4f。由图4f 可知，在100～500 W 之间，随着超声波功率的增大，类胡萝卜素得率逐渐升高，当超声波功率为500 W 时，得率达到最大值，这表明超声波破碎细胞可显著促进溶质的提取[20-21]。当超声波功率大于500 W 时，类胡萝卜素得率显著降低，表明过高的超声波功率会降解类胡萝卜素，并导致其得率降低[22-24]。因此，选择500 W 的超声波功率较适宜。

2.5 响应面优化试验结果

2.5.1 模型方程的建立 响应面试验设计和结果见表2。经回归分析得到回归模型方程：Y=-6500.86+197.35X1+18.87X2+71.32X3+0.17X1X2+0.25X1X3-0.08X2X3-1.47X12-0.44X22-0.80X32。

Box-Behnken 试验设计的方差分析见表3。由表3 可知，本研究所得回归模型极显著（P＜0.0001），失拟不显著（P=0.8688），决定系数R2为0.9917，表明该模型拟合较好，能充分反映自变量与类胡萝卜素得率之间的关系。根据方差分析，将差异不显著的因子剔除后得到的回归方程：Y=-6406.56+197.35X1+15.10X2+69.44X3+0.17X1X2+0.25X1X3-1.47X12-0.44X22-0.80X32。

表2 响应面试验设计和结果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回归模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

2.5.2 自变量对响应值的影响 响应值受到回归方程的回归系数影响。由表3 可知，X1，X2，X3，X1X2，X1X3，X12，X22，X32项对响应值均有显著影响，而X2X3影响不显著。固定3 个因素中的1 个因素在0 水平，得出其余2 个因素的交互作用对类胡萝卜素得率影响的响应面图，见图5。由图5 可知，因素与响应值呈抛物线关系，任何两个因素的交互作用都存在最大的响应值，表明各因素所选取的范围较合理。

图5 各因素交互作用对类胡萝卜素得率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots for the interactive effects of various factors on the yield of carotenoids

2.5.3 最适提取条件 采用Design-Expert 软件优化类胡萝卜素的最适提取条件为：乙醇体积分数73.4%，提取时间30.4 min，提取温度54.4 ℃。在此条件下，类胡萝卜素得率的预测值为2 969.23 μg/g，而验证试验的实测值为（3 017.31±34.60）μg/g，预测值和实测值之间的相对误差为1.59%，差异不显著，证实了该模型的实用性和准确性。

3 结论

以蛹虫草子实体为原料，通过比较7 种提取溶剂，确定了可食用的乙醇溶液最适合蛹虫草新型类胡萝卜素的提取。超声波破碎法提取蛹虫草类胡萝卜素的得率显著高于传统的酸热法，且无环境污染。经单因素试验和响应面优化得到蛹虫草子实体中新型类胡萝卜素的最适提取工艺参数：乙醇体积分数73.4%，料液比1∶60，超声波功率500 W，超声波处理时间20 min，提取温度54.4℃，提取时间30.4 min。在此优化条件下，类胡萝卜素得率可达3 017.31 μg/g。本研究为蛹虫草的深加工提供了一种高效、（食用）安全、无环境污染的新型类胡萝卜素提取工艺参数，具有重要的科学意义和应用价值。