陈健乐 程 焕 陈士国 郭东启 叶兴乾*

（1 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 智能食品加工技术与装备国家地方联合工程实验室 浙江省农产品加工技术研究重点实验室 南方果蔬保鲜技术集成科研基地 浙江省健康食品制造与品质控制国际合作基地 浙江大学馥莉食品研究院 杭州 310058 2 浙江大学宁波研究院 浙江宁波 315100）

果胶广泛存在于陆生植物的细胞壁中，其作为天然健康的食品胶体被大量用于食品工业或其它行业的增稠凝胶剂，全球年产量达6 万t，然而仍供不应求[1]。柑橘是最主要的果胶原料，传统商品果胶一般用柠檬或甜橙皮提取，宽皮柑橘因白皮层薄、果胶得率相对较低、凝胶性较差而较少使用。近年来，针对柑橘罐头（温州蜜柑Citrus unshiu）加工脱囊衣工艺水中果胶含量高、水用量大、化学需氧量高的特点，作者建立了从中回收柑橘囊衣果胶的工艺与生产线，并获得产品，促进了对宽皮柑橘果胶资源的利用，同时推动了柑橘罐头加工清洁化与高值化发展[2]。

柑橘罐头脱囊衣使用较低温度的酸与碱处理，时间较短[3]。而传统商品果胶多采用高温酸提法，一般使用硫酸、盐酸、硝酸、草酸等在60～100 ℃下提取1 h 以上[4-6]，二者所得果胶在性质上差异较大，前者多为RG-I 果胶，后者则以HG 为主商品果胶。从原料的角度分析，柑橘罐头加工使用最多的品种为晚熟温州蜜柑，生产中常按果实大小分为大、中和小3 个级别，水果的果实大小不仅影响果实各部分比例，也可能对其植物化学素的含量有所影响[7-9]。

本研究以温州蜜柑的囊衣为原料，柑橘按罐头生产方法分为大橘、中橘和小橘，模拟罐头脱囊衣工艺及商品果胶的提取工艺，验证工艺技术及果实大小对囊衣果胶性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘原料及处理：成熟温州蜜柑（Citrus unshiu）果实，从象山华宇食品有限公司的生产线上取得，根据企业的生产方法，将果实大小分为大橘、中橘、小橘（具体尺寸与质量分级见图1）。手工分离果实的囊衣，对收集的囊衣用沸水烫漂5 s进行灭酶并洗去游离糖，在烘箱中45 ℃干燥至水分含量低于5%，密封后保存于干燥器中，待用。

氢氧化钠、盐酸等试剂，国药集团化学试剂有限公司；各种单糖标准品，美国Sigma-Aldrich 公司；Gal-3 蛋白，美国R &D Systems 公司。

图1 柑橘的尺寸与质量分级Fig.1 Grading of mandarin by fruit size and weight

1.2 仪器与设备

高效液相（e2695、1525）和2414 示差检测器，美国Waters 科技有限公司；DAWN Heleos-II 光散射检测器，美国Wyatt 技术公司；Nicolet Avatar 370 红外分析仪，美国Nicolet 仪器技术公司（Thermo）；ZM200 超离心粉碎机，德国Retsch 公司；Biacore 3000SPR 仪，瑞典GE Healthcare 公司。

1.3 3 种提取法的工艺流程

本试验设计高温酸提（商品果胶工艺）和低温酸提（柑橘罐头生产酸处理）、低温碱提（柑橘罐头生产碱处理）3 种工艺，流程见图2，具体参数参照罐头工业手册[3]。果胶样品干燥后，以囊衣原料干重为基础计算得率。

图2 提取工艺流程Fig.2 Flow chart of extraction processes

1.4 单糖组成

样品水解：称取2 mg 果胶样品于安瓿瓶中，溶解后在2 mol/L 三氟乙酸（TFA）下水解，水解条件为110 ℃，8 h。待反应完全后冷却至室温，使用氮吹仪50 ℃下吹干。用0.1 mol/L NaOH 调样品pH 至中性，用水定容1 mL，备用。

单糖组成使用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生紫外检测法测定，根据文献[10]和[11]并略作改动。将400 μL 单糖混标（2 mmol/L）或样品水解液和450 μL NaOH（0.3 mol/L）、50 μL乳糖（0.002 mol/L）、450 μL 0.5 mol/L PMP（甲醇作溶剂）混匀，70 ℃水浴反应30 min，冷却后加入450 μL 0.3 mol/L HCl，混匀，再使用氯仿多次萃取过量PMP，过0.22 μm 水膜，滤液进行色谱分析。使用高效液相色谱（Waters e2695）、Agilent XDB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外检测器（Waters 2489）在25 ℃，250 nm 下分离检测。流动相：溶剂A 为15%（体积分数）乙腈+0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8），溶剂B为40%（体积分数）乙腈+0.05 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）；梯度模式：溶剂B 的体积分数变化为0%→15%→25%→25%，对应的时间为0 min→10 min→30 min→35 min。根据混标各单糖的峰面积与浓度，计算各单糖的响应因子，将样品各单糖折合响应因子后计算相对比例（mol%）。

1.5 红外光谱分析

测试前将果胶样品使用105 ℃烘箱干燥6 h以上，充分去除水分，以减少杂峰干扰[12]。与KBr在红外灯下混合后用红外光谱仪测定，以KBr 为空白背景在400～4 000 cm-1扫描。扫描次数为32次，分辨率为4 cm-1。获得红外谱图用于多糖的鉴定与结构分析。

果胶的酯化度计算参考文献[13]～[15]的方法。红外图谱中1 740 cm-1和1 630 cm-1处的峰分别对应果胶半乳糖醛酸上COOCH3和COO-的C=O伸缩振动。果胶的酯化度（DE 值）计算公式：

式中，Area1740——红外吸光度图谱中1 740 cm-1峰面积；Area1740+1630——1 740 cm-1与1 630 cm-1的峰面积之和。

1.6 绝对分子质量与链形态

参考文献[16]的方法并略有改动。用0.2 mol/L NaCl 溶液溶解样品，配制样品质量浓度为0.5 mg/mL，使用0.45 μm 滤膜过滤样品，滤液用高效液相色谱与光散射及示差串联系统（HPSECMALLS-RI）检测分析。流动相：0.2 mol/L NaCl（含抑菌剂NaN30.02%）；流速：0.75 mL/min；色谱柱：Shodex OH SB-G（保护柱）以及Shodex SB-806 HQ（13 μm，8.0 mm×300 mm，排阻限2×107）和SB-804 HQ（10 μm，8.0 mm×300 mm，排阻限1×106）联用；数据处理使用软件Astra 6.1。

1.7 果胶与半乳糖凝集素-3（Gal-3）的亲和强度

参考文献[17]的方法，使用表面等离子体共振仪测定果胶与半乳糖凝集素-3（Gal-3）的亲和强度。CM-5 芯片先用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，然后加载Gal-3 蛋白，果胶样品溶解于HBS-EP 缓冲液（10 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，3 mmol/L EDTA，0.005%表面活性剂P20），配制成梯度浓度依次进样，进样量90 μL，25 ℃下测试SPR 曲线。最后采用软件BIAevaluation 4.1.1 拟合SRP 曲线，并计算KD值。

1.8 数据分析

使用SPSS 20.0（美国IBM）进行数据分析，采用单因素方差分析（Duncan）进行统计（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 原料果实组成比例与果胶提取得率

不同大小橘子的组成比例见表1。大橘的橘皮与囊衣占比均多于小橘，小橘皮薄、囊衣少。小橘囊衣虽薄，但酸提果胶得率反而高（因得率的计算是基于相同的原料干重，而非相同的橘子个数）（表2），提示小橘囊衣的变薄可能由非果胶物质（如纤维素、半纤维素等）的减少引起。同时由于非果胶大分子的减少，减少了其与果胶的缠绕与结合[18]，因此在酸的作用下果胶更容易被提出。低温碱提是对低温酸提的渣进行提取，因小橘酸提容易提出果胶，故小橘碱提得率有所下降，具有合理性。

表1 不同果实大小的柑橘各部分所占比例（以100 g 鲜果计）Table 1 The weight ratio of each fruit part in different size mandarin fruits（presented as each 100 g fresh fruit）

表2 大、中、小橘囊衣在3 种提取工艺下的果胶得率（基于囊衣干重，%）Table 2 Yields of the pectin extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods（based on the dry basis of segment membrane，%）

2.2 提取工艺与果实大小对果胶理化性质的影响

单糖组成分析表明，无论柑橘的果实大小，通过高温提取具有较多的半乳糖醛酸，而低温则相反（有较多的中性糖侧链）；碱提取具有更高的中性糖含量（表3）。

由表3 可知，大、中、小橘在相同提取工艺下，单糖组成相似。高温酸提的果胶GalA 高，之后为低温酸提和低温碱提，说明高温酸提得到标准的商品果胶。大橘在高温酸提下Gal 含量偏低，在低温酸提下大橘的Gal 与Ara 偏低。由于Ara 易水解，推测高温酸提大橘Ara 的提出量同样偏低，只是大、中、小橘在高温提取中Ara 均有水解而未显示出差异。Gal 和Ara 是RG-I 结构的支链组成[19]，表明大橘酸提果胶中RG-I 支链较短。

表3 大、中、小橘囊衣在3 种提取工艺下果胶的单糖组成（mol%）Table 3 Monosaccharides composition of the samples extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods（mol%）

图3 可见，大、中、小橘囊衣果胶在同一种提取工艺下的图谱信号峰相似，提示果实大小对果胶多糖的基团特征没有影响，而不同提取工艺下差别显著，如1 750～1 600 cm-1的酯化度相关信号，以及1 300～1 200 cm-1的指纹图谱区，酸提与碱提有较大差异。

表4 为根据红外谱图计算的酯化度，表明果实大小对酯化度没有影响。而提取工艺不同则有很大差别，碱提的脱酯作用明显。

图3 大、中、小橘囊衣在3 种提取工艺下果胶的红外谱图Fig.3 FTIR spectra of the samples extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods

表4 大、中、小橘囊衣在3 种提取工艺下果胶的酯化度（%）Table 4 Degree of esterification of the samples extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods（%）

表5 显示，低温碱提分子质量大于低温酸提，更大于高温酸提。大橘重均分子质量小于中橘和小橘。分子质量的微分重量分布图也能直观显示大、中、小橘的差异（以高温酸提为例，图4a），结合糖组成的结果，分析原因可能是由大橘果胶中性糖侧链少所致，这与大橘非果胶大分子多，从而与果胶缠结多的猜想相符，即可以解释为大橘果胶主要由相对易于被提取（侧链较少，缠结少）的果胶组成，因此分子质量较小。

大、中、小橘在每种提取工艺下的果胶分子链形态差异小（以高温酸提为例，图4b），根据拟合斜率分析其均为分支结构[20]，碱提果胶分支最严重。

表5 大、中、小橘囊衣在3 种提取工艺下的果胶分子质量与旋转半径Table 5 Average values of molecular weight and radius of the extracted pectin

图4 大、中、小橘囊衣在高温酸提下的果胶分子质量与链形态Fig.4 Molar mass distribution and conformation of the samples extracted from large，middle and small fruits under hot acid extraction

2.3 低温酸提下果实大小对半乳糖凝聚素-3（Gal-3）亲和力的影响

据报道，RG-I 果胶具有结合Gal-3 的活性，而结合Gal-3 与抗癌等多种生理活性相关[21]。上述结果表明，低温酸提能较好地保留富含中性糖侧链的RG-I 结构。比较了低温酸提的大、中、小橘果胶的Gal-3 亲和力。图5 显示，大、中、小橘果胶的KD值在4.13～5.51 μmol/L 之间，表明果实大小对所提果胶的Gal-3 亲和力影响小，这与其果胶结构相近的结论相符。其Gal-3 的亲和力均属于中等结合强度，与富含RG-I 的其它果胶多糖活性相近[17，22]。

图5 低温酸提果胶与Gal-3 相互作用的SPR 信号图（黑细线为拟合曲线）Fig.5 SPR sensorgrams of pectin-Gal-3 interaction（the black curves are the fitting curves）

3 结论

对于宽皮橘囊衣果胶，在提取率、单糖组成、酯化度、分子质量和Gal-3 结合活性方面，果实大小对其影响不大，而提取工艺则有很大的影响。传统的商品果胶工艺，所得果胶半乳糖醛酸较多，中性糖含量较少，分子质量相对较小；低温的酸提取则得到分子质量更大的果胶，中性糖支链保留较多，而半乳糖醛酸数量降低；低温碱提取分子质量最大，几乎无酯化度，存在大量的中性糖。

本研究结果同时表明柑橘中存在着大量的不同性质的多糖，提取的果胶多糖结构主要取决于提取工艺的差异。