林玉兰，许立萍，孔祥臣

(1.焦作煤业(集团)有限责任公司中央医院一分院内二科；2.焦作煤业(集团)有限责任公司中央医院呼吸二科，河南 焦作454000)

有数据显示，肺癌5年生存率≤15%，且80%肺癌患者为非小细胞肺癌 （non-small cell lung cancer，NSCLC）,同时由于NSCLC早期症状不具有典型性，导致≥50%肺癌患者确诊时已处于局部进展或远处转移时期[1]。临床早期筛查NSCLC的主要方式为电子计算机断层扫描（CT）检查及胸部，而CT检查虽准确度较高，但其费用昂贵，辐射较强，患者难以接受；胸片检查敏感性、准确性较低，难以达到临床预期效果。近年来由于影像学检查敏感性较低，造成NSCLC病死率升高≥5%，因此提高晚期NSCLC诊断敏感性,有助于完全切除肿瘤病灶，改善患者5年生存率，挽救患者生命[2]。有学者指出,血清癌胚抗原（CEA）、糖类抗原199（CA 199）、糖类抗原 125（CA125）水平在早期及中晚期NSCLC诊断中虽具有一定诊断价值,但其漏诊率仍高达29%[3]。循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）与肿瘤血行转移与肿瘤复发存在紧密联系。本研究选取84例经病理结果确诊为晚期NSCLC患者,通过分析对比,观察CTC联合血清CE A、CA199、CA125水平检测的临床诊断效能。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年10月-2018年7月我院53例经病理结果确诊为晚期NSCLC患者为NSCLC组，31例肺部良性病变患者为肺部良性病变组,并选取56例同期健康体检者为健康对照组。其中NSCLC组男32例，女21例，年龄45～75岁，平均年龄（60.15±7.04）岁，29 例腺癌，24 例鳞状细胞癌，临床分期：35例III B期，18例IV期；肺部良性病变组男19例，男12例，年龄46～76岁，平均年龄（59.98±6.92）岁，其中 4 例肺炎、8 例肺结核、10例支气管扩张、4例肺纤维化、5例结核性胸膜炎。健康对照组男30例，女26例，年龄44～77岁，平均年龄（60.07±6.98）岁。 3 组基本资料（年龄）均衡可比（P＞0.05）。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 选取标准 ⑴纳入标准：患者及家属知情并签署同意书；NSCLC组均经CT、磁共振成像（MRI）等检查确诊为NSCLC，均处于III B～IV期；⑵排除标准：合并心肝肾等严重功能不全；伴有其他恶性肿瘤；伴有凝血功能异常；合并自身免疫系统疾病；严重精神疾病或认知障碍。

1.3 方法

1.3.1 CTC检测具体步骤如下 ⑴主要试剂：人淋巴细胞分离液(上海江林生物科技有限公司提供)、小鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体 （北京北纳创联生物技术研究院提供）、4，6-二脒基-2苯基吲哚（购自上海谱振生物科技有限公司）、异硫氰酸荧光素标记羊抗小鼠IgG（购自北京百奥莱博科技有限公司）。⑵收集标本：消毒后，以真空采血针取穿刺后肘正中7.5ml静脉血,并加入肝素抗凝混匀，24h后富集肿瘤细胞。⑶富集肿瘤细胞（密度梯度离心法）：取抗凝全血（7.5ml）+磷酸盐缓冲液（PBS，7.5ml）混匀，并以2：1比例加至细胞分离液层面上；在室温条件下，2000r/min，离心时间持续20min，另外吸取环状乳白色单核细胞层+PBS（5ml）洗涤，重复 2 次，2000r/min 离心 15min。 ⑷染色（免疫荧光法）：采用载玻片将单个核细胞悬液均匀涂抹，室温下静置30min后，采用多聚甲醛（4%）对抗原进行固定,10min，PBS清洗,持续5min，重复3次，玻片干燥后统一置于-80℃冰箱进行染色；室温下采用Triton X-100（0.1%）通透包膜15min，PBS清洗5min，重复3次；将牛血清清蛋白（5%）封闭于37℃室温下30 min,PBS清洗5min，重复3次；滴加1：100小鼠抗Pan-细胞角蛋白,并置于 4℃条件下12h，PBS清洗 5min，重复3次；滴加1：100 FITC标记羊抗小鼠IgG，室温条件下孵育2h，PBS清洗5min，重复3次；最后在细胞区添加DAPI染细胞核（7μl），对玻片加盖封固，并利用免疫荧光显微镜对上述步骤进行观察与照相。

1.3.2 血清CEA、CA199、CA125水平检测 采用全自动电化学发光免疫分析仪 （产自北京西化仪科技有限公司）检测血清CEA、CA199、CA125水平，严格按照仪器说明书操作。

1.4 阳性判定标准 ⑴CTC：长径10μm；细胞形状为椭圆形、圆形；经光镜可观察细胞核及细胞形态完整；细胞质经Pan-细胞角蛋白染色被染成黑色或蓝色。 ⑵CEA＞10U/ml,CA125＞35U/ml,CA199＞30.9U/ml。

1.5 观察指标 ⑴比较两组血清血清CEA、CA199、CA125 水平。 ⑵CTC、CEA、CA199、CA125及四者联合检测结果。⑶CTC、CEA、CA199、CA125及四者联合准确性（ACC）、灵敏性（SEN）、特异性（SPE）、阴性预测值及阳性预测值。

1.6 统计学分析 采用SPSS24.0软件分析数据，计量资料用(x±s)表示，行 t检验，计数资料用 n（%）表示，行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清CEA、CA199、CA125水平 三组血清CEA、CA199、CA125水平比较差异有统计学意义（P＜0.05）；NSCLC 组血清 CEA、CA199、CA125 水平高于肺部良性病变组、健康对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组血清CEA、CA199、CA125水平(x±s)

表2 CTC、CEA、CA199、CA125及四者联合检测结果

2.2 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者联合检测结果 CTC检出真阳性38例，真阴性29例，漏诊15例,误诊2例；CEA检出真阳性32例,真阴性28例,漏诊21例,误诊3例；CA199检出真阳性35例，真阴性26例，漏诊18例，误诊5例；CA125检出真阳性30例，真阴性27例，漏诊23例，误诊4例；四者联合检出真阳性51例，真阴性25例，漏诊2例，误诊6例，见表2。

2.3 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者联合诊断价值 四者联合ACC、SEN、阴性预测值高于CTC、CE A、CA199、CA125（P＜0.05）；四者联合与 CTC、CEA、CA199、CA125阳性预测值、SPE无显著差异（P＞0.05），见表 3。

表 3 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者联合诊断价值 n（%）

3 讨论

有数据显示,每年肺癌死亡人数约占全国死亡人数的20%，对患者生命安全造成严重威胁[4]。目前临床诊断晚期NSCLC的手段主要有影像学检查、血清肿瘤标志物、肺穿刺活检等，其中血清肿瘤标志物具有创伤小、操作简单、费用便宜等显著优势，同时其SEN及ACC较高，可有效用于指导临床晚期NSCLC诊治。杜军华等[5]研究发现，血清CEA、CA199、CA125水平升高与晚期NSCLC疾病进展生存期有密切联系,可有效指导临床对晚期NSCLC疗效及预后进行评估与判断。

CEA是一种酸性糖蛋白,属于肿瘤相关抗原（非器官特异性），多存在于胃肠道、泌尿道等空腔脏器，而糖蛋白主要成分为肽链、糖链，多位于组织细胞（巨噬细胞、多核细胞及单核细胞）与末梢血中，是肺癌血清肿瘤标志物之一[6]。赵松林等[7]研究发现血清CEA是评估晚期的重要敏感指标之一，且其水平过度表达与肿瘤复发有密切联系。本结果显示,观察组血清CEA水平高于健康对照组（P＜0.05）,且其 SEN 为 60.38%，SPE 为 90.32%。提示血清CEA诊断晚期NSCLC SPE较高，在晚期NSCLC诊断价值较高。

CA125作为高分子糖蛋白,主要由体腔上皮细胞表达，健康者血清CA125水平较低，而组织发生恶变者血清CA125水平升高[8]。CA125最早主要应用于诊断子宫癌与卵巢癌,而近年来相关研究发现恶性肿瘤（其他组织器官）中其水平也会提高，有数据显示≥50%肺癌患者血清CA125水平存在升高现象[9]。王秋波等[10]研究发现，血清CA125半衰期较短，对晚期NSCLC治疗效果具有监测作用，可显著反映肺癌近期变化。CA199是一种糖类抗原，属于低聚糖类粘蛋白,多存在于恶性肿瘤细胞表面、胚胎胃肠粘膜上皮，是临床诊断胰腺癌及直肠癌的血清肿瘤标志物之一。近年来有学者指出，CA199具有广谱性抗原，同时其水平在肺癌、卵巢癌等其他恶性肿瘤中也存在升高现象[11]。李岚等[12]研究认为，血清CA199在NSCLC化疗效果评估中具有重要意义。本文结果显示,观察组血清CA1 25、CA199 水平高于健康对照组（P＜0.05）。 提示血清CA125、CA199对晚期NSCLC诊断具有指导意义。

NSCLC血行早期转移会导致异常增殖 （肿瘤细胞、相关肿瘤凋亡细胞）及单核细胞显著增多，一般认为晚期NSCLC远处转移的必备条件是血清中相关肿瘤细胞出现表达异常[13]。范凡等[14]研究发现，CTC与恶性肿瘤（乳腺癌等）的远处转移密切相关,可有效用于辅助尽早发现肿瘤微转移及复发。另外王汉萍等[15]研究还发现，CTC检测可确定相关基因突变类型,为晚期NSCLC治疗策略提供科学依据。此外费小东[16]研究显示CTC联合多种肿瘤标志物诊断晚期NSCLC,可有效提高晚期NSCLC诊断鉴别效果。本文结果显示，四者联合ACC、SEN、 阴性预测值高于 CTC、CEA、CA199、CA125（P＜0.05），且阳性预测值、SPE 无显著差异（P＞0.05）。提示四者联合诊断晚期NSCLC，可有效提高ACC及SEN，优化诊断效果。

综上所述，CTC联合血清CEA、CA199、CA125水平检测晚期NSCLC ACC及SEN较高，可为临床选择治疗方案与判断预后提供科学依据。