郑剑锋 ，杨峻 ，李金平 ，杨小洁 ，邵文华 ，秘思思

((1.深圳市宝安区中心医院/深圳大学第五附属医院，广东 深圳 518102；2.桂林医学院，广西 桂林 541004)

肝细胞癌 （hepatocellular carcinoma，HCC），简称肝癌，是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。中国作为肝癌高发地区，多年来发病率、死亡率居高不下，严重地威胁着人民的健康。全球每年新增病例约85万例，死亡病例约80万例，我国的新增病例与死亡病例约占全球总数的一半以上[1-5]，其中，20~39岁的年轻患癌人群中死亡率最高的是肝癌[6]。肝癌发生的分子机制是研究热点，Poly(A)结合蛋白相互作用蛋白1（Poly(A)binding protein interacting protein 1，PAIP1）在蛋白质翻译起始过程中发挥作用，已有研究发现PAIP1参与乳腺癌[7]、胰腺癌[8]、胃癌[9]等肿瘤发生、发展过程，但PAIP1在肝癌中的作用目前尚不明了。本研究通过实时荧光定量PCR和免疫组化等技术检测肝癌临床标本中PAIP1的表达水平,分析PAIP1表达水平与肝癌患者临床特征之间的关系。

1 资料与方法

1.1 组织标本 22例新鲜组织标本,为2017年6月-2017年12月在桂林医学院附属医院肝胆外科手术切除的肝细胞癌组织 (术后均经病理学证实),每例均包括肝细胞癌组织及距癌灶距离不少于2cm的无瘤正常肝组织。术中切除后半小时内立即投入液氮罐中,随后放入-80℃冰箱中保存备用。包含90例病例的组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司。本研究患者知情同意，同时通过医院伦理委员会备案。

1.2 PAIP1表达水平检测 依照Invitrogen公司的Trizol试剂操作说明书进行培养细胞及肝癌组织RNA提取,根据Promega公司M-MLV操作说明书进行RNA逆转录成cDNA，采用两步法进行Real-Time PCR反应，引物序列见表1，目的基因的表达水平采用Ct值比较法[10,11]。使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，酶标仪BCA法测蛋白浓度，将蛋白浓度调至合适浓度，变性处理后8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，250 mA电流半干转至NC膜。室温下5%脱脂奶粉封闭30min。用小鼠抗PAIP1的一抗(1：1 000)4℃过夜，PBST洗膜,用羊抗小鼠二抗 (1∶2000)孵育 2h，PBST洗膜，ECL发光显影检测PAIP1在蛋白水平的表达情况。

表1 PCR引物序列

1.3 组织芯片PAIP1免疫组化检测 PAIP1抗体稀释比例为 1：6000，以 PBS做阴性对照，免疫组织化学采用SP法进行免疫组化检测，使用肝细胞癌组织芯片进行实验，对癌组织和癌旁组织（上皮）分别进行产生的所有PAIP1抗体胞浆表达的原始实验数据进行判读，判读PAIP1胞浆染色的染色强度（0/1+/2+/3+）和染色阳性率。

1.4 PAIP1预后在线数据分析 基于在线数据库分析PAIP1与HCC预后的关系。登陆数据库首页：(http：//kmplot.com/analysis/index.php p=service&cancer=liver_rnaseq)，输入基因PAIP1，设定参数，对应的随访数据纳入病例322例。

1.5 统计学分析 采用GraphPad Prism6.0版软件进行数据分析。定量数据用t检验，定性数据用Wilcoxon检验，生存分析用Kaplan-Meier法，Logrank检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织中PAIP1mRNA的表达水平高于癌旁组织 与癌旁组织相比，22例病例中癌组织中PAIP1表达上调的有17例，变化不明显的有3例，表达下调的有2例，配对t检验，P=0.0002，癌组织表达水平高于癌旁组织，见图1。

图1 PAIP1在癌及癌旁组织中的表述水平

2.2 PAIP1在肝癌细胞中表达水平增高 与正常肝细胞LO2相比，常见肝癌细胞系中，PAIP1在肝癌细胞系 SMMC7721、HepG2、Huh-7中的表达水平增高，结果见图2。

图2 PAIP1蛋白在常见肝癌细胞系中的表达情况

2.3 组织芯片中癌组织PAIP1表达水平较癌旁组织增高 PAIP1蛋白在癌组织和癌旁组织的比较，癌组织中蛋白表达水平高于癌旁组织 （配对等级资料Wilcoxon检验，P=0.03），组织芯片免疫组化的典型图片见图3。

图3 组织芯片PAIP1的免疫组化典型图片

2.4 PAIP1表达水平与肝癌预后相关 Kaplan-Meier Plotter在线预后分析显示，PAIP1表达水平与患者OS(HR=1.79)相关(P=0.0013)，见图4。

图4 不同PAIP1表达水平的肝癌患者生存曲线

3 讨论

HCC发生过程中的一个重要特征是蛋白质翻译过程的异常,表现为调控蛋白质翻译的重要信号途径mTOR信号通路的异常及蛋白质翻译过程的重编程[12,13]。在蛋白质翻译起始过程中，翻译起始过程是限速步骤,影响起始过程的因素对蛋白质翻译过程有重要作用。除翻译起始因子外，Poly(A)结合蛋白相互作用蛋白1（Poly(A)binding protein interacting protein 1，PAIP1）的作用比较特殊，PAIP1 可与eIF3和eIF4A互作,形成Paip1-eIF3-eF4G和Paip1-PABP-eIF4G复合物，促进了mRNA环形结构的形成,迄今为止,人类中只发现PAIP1参与mR NA环化衔接,因此，PAIP1是蛋白翻译起始必须因子[14,15]。已有研究发现PAIP1参与乳腺癌[7]、胰腺癌[8]、胃癌[9]等肿瘤发生、发展过程，本研究发现，PAIP1具有结合RNA的作用，可能在肿瘤发生、发展中发挥作用[16]。但PAIP1在肝癌中的作用目前尚不明了，因此，明确PAIP1在肝癌的发生、发展过程的作用及分子机制,可能为肝癌治疗及预防提供新思路。

本研究发现,组织芯片中PAIP1蛋白在肝细胞癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,生存分析表明，PAIP1低表达组的生存率高于PAIP1高表达组的生存率，提示PAIP1表达水平与病人预后相关，PAIP1可能在肝癌发生发展过程中发挥作用。新鲜肝细胞癌组织PAIP1的mRNA表达水平高于在癌旁组织,肝细胞癌细胞系中PAIP1的蛋白表达水平也较正常肝细胞表达水平高。Real-time PCR检测PAIP1 mRNA水平及免疫组化检测PAIP1蛋白水平，结果均表明PAIP1在肝细胞癌组织中的表达水平高于癌旁组织，提示PAIP1可能为肝细胞癌相关基因。

本研究应用免疫组化染色和RT-PCR方法，结合在线数据库分析患者临床资料及生存情况，发现PAIP1高表达是HCC一个不良预后因素，提示PAIP1可能成为一种新的分子治疗靶点。为了进一步揭示PAIP1在肝细胞癌发生发展过程中的作用及机制,下一步将在其他患者人群或扩大样本量加以验证。