刘晓庆,李健雄，刘师文，肖芳，施勇，熊英

(江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029)

消灭脊髓灰质炎的最终目的是阻断脊髓灰质炎野病毒的传播,目前这一工作已取得了重大进展,并且Ⅱ型脊髓灰质炎病毒已从自然界消失[1]，事实上导致15岁以下的儿童出现麻痹的，除了脊髓灰质炎病毒外，还有许多非脊灰肠道病毒。近些年来，随着脊灰病毒的消灭，由非脊灰肠道病毒引起的急性弛缓性麻痹越来越吸引人们的眼球。为了解NPEV的分布特征和流行病学规律,迫切需要对NPEV中的肠道病毒进行型别鉴定。近年来，国际上建立了应用分子生物学方法对肠道病毒进行分型鉴定的方法,为探索江西省急性弛缓性麻痹病例中的NPEV的感染情况,本研究对2013年-2017年从急性弛缓性麻痹(AFP)病例中分离到的NPEV进行分子定型，探讨其型别分布情况以及流行病学规律。

1 材料

1.1 数据资料来源 AFP病例资料来源于AFP病例监测信息管理系统数据库、江西省疾病预防控制中心脊灰实验室监测数据。

1.2 粪便标本处理 来源于2013年-2017年江西省AFP病例监测系统报告的AFP病例(15岁以下儿童),绝大部分病例按照WHO的要求采集双份粪便，所有粪便标本按照WHO《脊髓灰质炎病毒实验室操作手册》处理后接种于WHO推荐的RD和L20B细胞[2]，出现病变后，采用实时定量PCR（real-time PCR）方法进行脊灰病毒型别鉴定。本文对历年来本实验室保存的存的脊髓灰质炎病毒株进行病毒型别鉴定。

2 方法

2.1 病毒核酸的提取及引物设计 取病毒培养液200μl，按 QIAamp Viral RNA Mini kit（试剂生产批号：130188374）试剂5滴说明书操作。RT-PCR及测序引物参照文献[3-5]按Oberste的方法选用不同的引物对（187/222，188/222，189/222）进行 VP1 区基因序列扩增，对用上述引物不能扩增的毒株，选用其他引物对扩增（187/011，040/011）扩增[6]，引物序列：

187：5′-ACIGCIGYIGARACIGGNNCA-3′；

188：5′-ACIGCIGTIGARACIGGNG-3′；

189：5′CARGCIGCIGARACIGGNGC-3′；

222：5′-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3′；

011：5′-GCICCIGAYTGITGICCRAA-3′

187：5′-ACIGCIGYIGARACIGGNCA-3′

040：5′-ATGTAYRTICCIMCIGGZGC-3′

2.2 RT-PCR与序列测定 RT-PCR反应条件参照文献[3]，PCR产物经凝胶电泳（1.5%凝胶，0.5ug/ml溴化乙锭）检测，阳性产物送上海生物工程有限公司测序。

2.3 结果分析 应用 Excel进行数据整理，应用SPSS 17.0统计学软件分析。

3 结果

3.1 NPEV分离率 2013年-2017年江西省共报告AFP病例522例,分离获得136株NPEV,AFP病例中NPEV的分离率各年有所不同,平均分离率为7.28%，详见表 1、表 2。

3.2 时间分布 2013-2017年每个月均可分离到肠道病毒，NPEV有明显的夏秋季高峰,分离率在5-8月均较高,5-8月份肠道病毒感染病例占49.81%，其中8月最高。见图1。

表1 江西省2013年～2017年AFP及其接触者NPEV分离情况

表2 不同年龄组AFP病例的非脊灰肠道病毒感染率

图1

3.3 地区分布 肠道病毒感染AFP病例分布于11个市,吉安市AFP病例肠道病毒感染率最高，为12.42%，其次为萍乡市 (12.24%)、新余市(11.39%)，景德镇市未分离得到肠道病毒，九江市和南昌市较低，为1.3%和1.6%。

3.4 人群分布 肠道病毒感染病例年龄2月龄～13岁,主要为5岁以下儿童，占80.15%(109/136)。男性病例感染率为63.97% (87例),女性为36.03%(49 例),见表 2。

3.5 测序定型结果 PCR产物经凝胶电泳检测，阳性产物送上海生物工程有限公司测序,阳性电泳图谱见图2。

对136株NPEV进行测序分型，132株有序列结果,分别属于A组肠道病毒(HEV-A)，HEV-B和HEV-C，无HEV-D病毒株，HEV-A包括7个基因型49株(37.12%,49/132),HEV-B组毒株包括14个基因型82株(62.12%,82/132)，HEV-C组毒株包括1个基因型1株(0.76%,1/132)。 见表3、表4、表5。

图2 部分非脊髓灰质炎肠道病毒PCR产物电泳图谱

表3 2013-2015年江西省NPEV基因分型分组鉴定结果

表4 2013-2015年江西省基因分型鉴定基因A组结果

表5 2013-2015年江西省基因分型鉴定基因B组结果

4 讨论

脊灰是严重危害儿童健康的急性传染病，曾经是致残的主要疾病之一[7]。消灭脊灰的工作目前已经取得重大进展，江西省2013年-2017年急性弛缓性麻痹病例中未监测到野病毒,证实江西已经消灭了脊灰野病毒，并实现了从1992年至今连续25年无脊灰野病毒病例发生的目标[8]。从而加强对AFP病例标本中非脊灰肠道病毒的监测,有助于进一步了解我省肠道病毒的循环特点。

本次监测结果显示,江西省2013年-2014年AFP病例粪便标本中的非脊髓灰质炎肠道病毒的平均分离率为7.28%,其中最高为12.87%（2014年），最低为2.80%（2015年）；其感染有明显的夏秋季节，与文献报道的结果类似[9,10]。可能夏秋季温暖湿润的气候有助于病毒的生存及繁殖；各地区的NPEV感染情况不同,其中景德镇市未分离到非脊灰肠道病毒；各年龄组的感染率也不同，主要分布在5岁以下小年龄组儿童中,男性比例高于女性，与文献[11]报道一致。

肠道病毒种类众多，血清型可分为A、B、C和D共4个组。一种型别的肠道病毒往往可引起几种疾病或病征,而一种疾病或病征也可因几种型别引起。因此，对病原体进行分型鉴定，后续可以进一步了解病毒型别与临床症状之间的关系，确定在一次疾病的暴发或流行中各病例间的流行病学关系,长期监测数据的积累可判断肠道病毒血清型的流行趋势。免疫接种过程中,部分小孩接种OPV后,会出现肢体麻痹等不良反应,其发生机制可能是由于疫苗株病毒的突变或返祖后对神经组织更具亲嗜性,但从AFP病例中分离出的不同型别的非脊灰肠道病毒，是否是引起AFP病例麻痹的原因，其致病机制以及不同型别的非脊灰肠道病毒引起的临床特征,将有待于进一步深化研究。基于全球消灭脊灰的进展，AFP病例的监测将重点关注NPEV的病原谱研究，病原谱的研究将为NPEV引起的疾病的诊断提供依据,为可能发生的暴发流行提供预测预警[12]。

近年来，随着分子生物学技术的发展，国内外陆续建立了一些用于肠道病毒分型鉴定的方法，并使用此法鉴定了许多新型EV。这些方法基于RT-PCR，然后进行核苷酸序列分析或分子杂交。

本研究根据文献报道设计了5对引物,对江西省省2013-2017年从急性弛缓性麻痹病例中分离到的136株非脊灰肠道病毒进行了VP1区基因扩增和序列分析。结果显示，以A组和B组的为主，与云南省报道的结果一致[13]。其中A组的EV71型别所占比例最高，表明近几年来江西省有EV71病毒的流行,但是否为江西省近5年非脊灰肠道病毒流行的优势毒株,还需要结合这几年的有关资料进一步分析判断。

本次检测中分离到的EV71型病毒,是能导致无菌性脑膜炎和手足口病的典型病毒,并可能引起暴发[14]。另外还分离到1株新型肠道病毒EV96，对新型肠道病毒详细的临床表现和流行病学特征有待进一步研究。江西省本次分离到的NPEV中，HEV-A和HEV-B和HEV-C组病毒都有，没有发现D组病毒，并以HEV-B组最多,而A组的EV71是主要流行病毒。

通过对江西省2013-2017年AFP病例粪便中NPEV的研究,初步探讨了AFP病例的NPEV病毒分布特点,也为今后江西省建立基于实验室的病原学监测奠定基础。