李秋华，周泽荣，祝晓丽，谭 颖，钟小英，姜荣华，宋 革

(广东省计划生育科学技术研究所生殖中心，国家卫生计生委男性生殖与遗传重点实验室，广东 广州 510600)

在多数育龄夫妇中，约15%的夫妇出现不孕不育。基于此，如何有效治疗不孕不育也是医学领域研究的热点问题，而实施体外受精(in vitro fertilization，IVF)是临床最常使用的治疗方法之一。精子透明带结合障碍是导致IVF受精率低的关键因素[1]，Meta文献分析表明，其能力对受精结局有较高的预测价值[2]。大约13%的精液参数正常的男性出现透明带结合障碍，而这一数值在少精症与畸精症男性中分别为56%和68%[3]。可利用透明带结合试验明确是否发生透明带结合障碍，但是由于人废卵来源有限，限制了其在临床上的应用，确定精子透明带结合能力和受精能力具有临床意义[4]。本研究拟对精子细胞膜表面SLEX/透明带(zona pellucida，ZP)结合蛋白展开定量研究，明确精子透明带结合及其受精能力，为辅助生殖中诊断精子-透明带结合缺陷的快速稳定方法，更有利于阐述精子及其透明带结合能力在辅助生殖中的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017年1月至2018年12月本院生殖中心的就诊者，年龄22～50岁，共76例精液标本(23例正常生育者，53例不育患者)。正常生育组纳入标准：均为健康成年男性，已有生育史，其精液常规各项检测指标正常(按照WHO第五版精液常规参数)，精浆及血清抗精子抗体阴性。不育组纳入标准：均为婚后1年以上不育(女方不孕因素已排除)，采用常规IVF治疗过程中女方获卵数大于5枚，受精率低于30%或者受精完全失败患者的精液标本。无既往相关病史，生殖器及其附属性腺体检未见异常。两组年龄比较差异无统计学意义(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1试剂 精子细胞BWW培养液 (Toscience公司)；Percoll分离液(由美国的Pharmacia公司提供)；荧光标记SLEX-牛血清蛋白(Invitrogen)；一抗鼠抗人C1orf56，ZPBP1，SPACA1单克隆抗体(Abcam)；络合异硫氰酸荧光素的豌豆凝集素(FITG-PSA)荧光标记试剂盒(生产厂家：安徽安科生物工程股份有限公司)。

1.2.2精子标本制备及分析与透明带结合 所有供精人员需要禁欲时间控制为5～7天，通过手淫方法取精液于无菌塑料杯中，待其完全液化后，利用精子分析仪开展常规的检查，包含精子浓度、形态等指标。采用半透明带试验(hemizona assay，HZA)分析不育组是否存在透明带结合障碍，选取正常生育组男性的精子作为对照组。卵子来源于ICSI过程中未受精卵，之前患者签署知情同意书。HZA结果用半透明带精子结合试验指数(HZI)表示，计算公式为不育组精子结合数/对照组精子结合数×100，HZI=30作为判断是否存在结合障碍的临界值，当HZI<30，认为存在障碍。

1.2.3精子自发顶体反应率检测 采用络合异硫氰酸荧光素的豌豆凝集素(FITG-PSA)荧光标记法顶体染色。取优化处理后的精子悬浮液5 μl涂片2张，自然干燥后以95%乙醇固定30 min。加入60～100 μl FITG-PSA工作液，4 ℃下反应2～17 h；用纯水冲片，1000倍油镜下观察，计数精子，并计算自发顶体反应率=顶体反应数/(顶体反应数+AI)×100%，AI为顶体完整的精子。

1.2.4精子膜表面SLEX结合蛋白的测定 采用流式细胞仪检测精子C1orf56，ZPBP1，SPACA1的免疫反应性以及与荧光标记的 SLEX-牛血清蛋白(SLEX-BSA，一种新生糖蛋白)的结合能力。取透明带结合障碍组精子加1 ml PBS洗涤并800 rpm离心收集细胞。按照抗体比例加入一抗，置于室温孵育1～2小时，1500 rpm离心5 min，去上清，加入PBS重悬细胞，重复3次，置于0.1 ml PBS中。加入荧光二抗，室温孵育1小时。500 rpm离心5 min，去上清，加入PBS重悬细胞，重复3次，最后置于0.2 ml PBS中，上机检测。

1.2.5Western Blot 检测精子膜蛋白中C1orf56，ZPBP1，SPACA1蛋白的表达水平 取透明带结合障碍组精子加l ml 4 ℃预冷的PBS洗涤并800 rpm离心收集细胞，加入细胞裂解液，充分作用后放置冰上；4 ℃条件下10分钟13 000 rpm离心后可见分为两相的溶液，蛋白膜位于两相之间，去除上层相和下层相，保留中间蛋白沉淀，-80 ℃冻存。通过蛋白免疫印迹法(Western blot)对C1orf56、SPACA1等指标进行检测。采用凝胶成像仪完成条带扫描，根据其与内参β-actin、GAPDH吸光度值之间的比值显示相对含量数值。

1.3 统计学方法应用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用卡方检验。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不育组透明带结合障碍的结果半透明带试验(HZA)中对照组采用23例正常生育的健康成年男性，不育组53例中采用常规IVF治疗过程中受精率小于30%或者受精完全失败患者的精液标本进行，分析不育组是否存在结合障碍，结果表明32例患者HZI<30，有60.4%的比例，认为出现透明带结合障碍。

2.2 精子自发顶体反应率检测结果荧光标记法顶体染色中，不育组透明带结合障碍患者的精子自发顶体反应率(25.05±6.45)% 显著高于对照组(5.12±2.12)%，差异有统计学意义(t=14.244，P< 0.001)；在不育组中，透明带结合障碍患者的精子自发顶体反应率(25.05±6.45)% 明显高于无透明带结合障碍组(15.32±4.76)%，差异有统计学意义(t=5.927，P< 0.001)。

2.3 精子膜表面SLEX结合蛋白的测定在精子膜表面SLEX结合蛋白中，不育组结合障碍患者的精子细胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1以及与荧光标记的 SLEX-牛血清蛋白的结合明显减少，差异有统计学意义(P< 0.05)。见表1。

表1 两组精子膜表面SLEX结合蛋白的测定比较

2.4 精子膜蛋白中各蛋白水平的表达精子膜蛋白中，不育组结合障碍患者的精子细胞中C1orf56、ZPBP及其SPACA1蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义(P< 0.05)。见表2。

表2 精子膜蛋白中C1orf56、ZPBP1、SPACA1蛋白的表达水平比较

3 讨论

在辅助生殖治疗的过程中患者行常规IVF或者ICSI的选择依据主要是精液常规分析结果，但精液常规分析不能提供关于精子功能如精子-透明带结合能力的相关信息[5～7]。这些夫妇由于其男方精液常规分析结果正常，在第一次辅助生殖治疗中，患者往往选择常规IVF而非ICSI。在精子-透明带结合异常的情况下存在受精率低甚至受精完全失败的风险，给患者双方带来了经济上与情感上难以弥补的伤害[8]。

为了改善这一类患者的治疗结局，希望利用可靠的检测方法诊断出存在结合障碍的精子，能降低受精失败的风险，改善临床结局。受精的第一步始于获能精子与透明带的结合，然后与透明带结合的精子发生顶体反应[9]。精子与透明带的结合始于精子膜表面的透明结合蛋白与透明带蛋白分子上的糖链结构发生结合[10]。近20年来，对于透明带糖蛋白上的多糖基分子研究较多，先前研究者采用超敏质谱分析法，确定SLEX是人透明带蛋白糖基上含量最多的糖链序列，同时还发现SLEX表位是精卵结合过程中透明带蛋白分子上主要的多糖性配体[11]。

部分精液参数正常的男性存在透明带结合障碍，进而导致不育[3]。本研究发现以23例正常生育的健康成年男性为对照组，对不育组采用常规IVF治疗过程中受精率低或者受精完全失败患者的精液标本进行HZA检测，分析不育组是否存在透明带结合障碍，结果表明32例患者HZI<30，有60.4%的比例，说明在IVF治疗中，受精率低与结合障碍相关。有研究[14]表明随 自 发 顶 体 反 应 率 的 增 加，受 精 率 和优胚率呈降低的趋势。而造成这种后果的机制尚不明确。目前，对参与精子透明带结合过程中的精子膜表面蛋白了解甚少，分子机制的尚不明确。在不育男性患者中，存在精子蛋白表达的异常[15]，但尚不明确其与透明带结合障碍之间的关系。本研究发现在精子膜表面SLEX结合蛋白中，不育组透明带结合障碍患者的精子细胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1以及与荧光标记的 SLEX-牛血清蛋白的结合比例均降低；在精子膜蛋白中，不育组透明带结合障碍患者的精子细胞中C1orf56、ZPBP1、SPACA1蛋白表达水平均降低，推测，这些变化可能通过提高精子自发顶体反应率来影响精子和透明带结合。

综上，本研究通过对精子表面SLEX/透明带结合蛋白的定量分析，探索精子与透明带结合机理。改善这一部分患者的临床诊断与治疗，在行辅助生殖治疗前，采用可靠的检测手段，精子自发顶体反应率高和(或)SLEX/透明带结合蛋白表达的降低对于预测受精情况有一定的价值对于提高辅助生殖技术的成功率有重要意义。