万慧颖，徐敏燕，李芳华，胥 颖，谢 震

(1.四川省医学科学院·四川省人民医院皮肤病性病研究所，四川 成都 610031；2.四川省医学科学院·四川省人民医院病理科，四川 成都 610072)

侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)是指侵袭深部组织的真菌感染，其临床诊断有时很困难，并且对侵袭性真菌感染患病率趋势的准确评估是一项挑战。Shimodaira[1]对日本Toho大学1955～2006年所有记录的真菌感染病例进行了尸检记录的回顾性检查。在10297例尸检中共检出411例IFI。其中曲霉菌病的患病率在52年期间增加，达到2.0%。近年来，随着各种先进的诊疗手段的运用，如干细胞和器官移植、恶性肿瘤的化疗和分子靶向治疗、广谱抗生素的广泛使用等，以及在获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)的患者中，IFI的发生率呈上升趋势。

直接从活检病理组织切片中检测到真菌感染是重要的诊断方法，但是常规HE染色、PAS染色和六胺银染色均存在一定的局限性。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种采用非放射性荧光物质标记种属特异性的探针，在待检测的细胞核或染色体中显示DNA序列具体位置的方法。本研究选择针对曲霉菌属18SrRNA的寡核苷酸通用探针，利用FISH技术检测石蜡包埋组织中的曲霉菌，初步探讨其在临床早期诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性收集四川省人民医院2010年1月至2018年12月经病理检查疑诊为曲菌感染的50例石蜡包埋存档标本。其中疑诊鼻腔鼻窦曲霉感染34例、支气管肺曲霉感染14例、皮肤曲霉感染2例。另设阳性对照组(经真菌培养已确诊为曲霉感染)、阴性对照组(经真菌培养已确诊为念珠菌感染)和空白对照组(不加探针)各10例。每份石蜡标本连续切片5张，分别做常规HE、PAS染色、六胺银染色、真菌荧光染色及FISH检测。

1.2 方法

1.2.1常规HE、PAS染色及六胺银染色 组织石蜡切片按照本院病理科染色方法进行常规HE、PAS染色及六胺银染色。

1.2.2真菌荧光染色 将石蜡切片在二甲苯中脱蜡，然后依次放入100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中，晾干后滴加真菌荧光染色液一滴，10% KOH一滴，混匀。轻轻加盖干净盖玻片一张，放置1 min后，在荧光显微镜下观察[2]。

1.2.3探针制备 参照文献[3]设计寡核苷酸探针18S-1，此探针以曲霉菌(Aspergillus)的18SrRNA作为靶序列，5′-端用6-FAM荧光标记。探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列为：5′-GCGGGTCATCATAGAAACACCGC-3′，长度为23个碱基。

1.2.4FISH检测 ①脱蜡：将石蜡切片在二甲苯中脱蜡，共3次，每次10 min，然后放入100%乙醇中脱蜡2次，85%乙醇及70%乙醇各脱腊1次，每次均为3 min；②消化：将蛋白酶K工作液滴加在组织切片上，于37 ℃下消化30 min，然后逐级移入70%乙醇、80%乙醇及100%乙醇内脱水，各2 min，空气干燥；③杂交：准备探针，滴加适量在组织上，压紧盖玻片后，用胶水密封，放入杂交仪中，37 ℃条件下杂交过夜；④洗涤：杂交结束后，去除胶水和盖玻片，常温下2×SSC洗涤液中洗涤2次，每次5 min。然后在梯度乙醇中脱水，空气干燥；⑤复染：在杂交区加入DAPI复染液，盖上盖玻片，在荧光显微镜下观察并分析结果。自步骤③开始均需避光操作。阳性、阴性和空白对照组同上述方法作FISH检测。

2 结果

2.1 常规HE、PAS染色及六胺银染色44例标本在常规HE染色下均可以见到具有分隔的菌丝，菌丝粗细、长短不一，部分菌丝可见角叉状分枝，分枝间约呈45°夹角(图1)，形态学上考虑为曲霉感染。50例标本在PAS染色及六胺银染色下均可以见到具有分隔的菌丝及45°角叉状分枝，染色后分别呈品红色和棕黑色 (图2和图3)，部分菌丝粗大且分隔不明显，形态学上难以完全与毛霉相鉴别。

图1 HE染色 可见具有分隔的菌丝，菌丝分枝约呈45°角(HE，× 400)

图2 PAS染色 可见品红色分隔菌丝，有45°角叉状分枝(PAS，×400)

2.2 真菌荧光染色46例真菌荧光染色的切片镜下均显示亮蓝色具有分隔的菌丝，可见清晰的菌丝轮廓，部分菌丝可见45°角叉状分枝 (图4)。

2.3 FISH检测采用18S-1寡核苷酸探针检测50例石蜡包埋标本，其中有32例呈阳性反应。菌丝壁和菌丝内可见大量绿色颗粒状荧光，部分颗粒状荧光排列成分枝状，杂交信号较强，容易判断，可以确定为曲霉菌(图5)。用18S-1寡核苷酸探针与阳性对照组(已确诊为曲霉感染)进行FISH，也可见绿色颗粒状的阳性杂交信号。与阴性对照组(念珠菌感染)进行FISH，呈阴性结果，未见绿色的杂交信号。空白对照组结果亦为阴性。

图5 荧光原位杂交 显示菌丝壁和菌丝内可见绿色颗粒状荧光，部分排列成分枝状(FISH，×400)

2.4 五种检测方法对比HE染色、PAS染色、六胺银染色、真菌荧光染色和FISH检测5种方法检测石蜡包埋组织中真菌感染，其结果对比见表1。

表1 5种方法检测石蜡包埋组织中真菌感染的结果 (例)

3 讨论

临床上深部真菌感染的早期诊断比较困难，导致很多患者病情延误。常规组织病理是采用直接镜检观察真菌的形态来诊断，但是许多真菌在组织中的形态相似，并且其形态会受多种因素的影响，故难以确定其种属。从临床或病理标本中培养真菌，所需时间一般为2周或更长，且深部真菌感染的病原菌常不易培养成功。如何准确地鉴定深部真菌感染的病原菌，已成为国内外学者探索的重要课题。

原位杂交技术(ISH)是指用已知标记的DNA或RNA探针，按照核酸杂交中的碱基配对原则，借助免疫组化技术在待测组织细胞内显示出目的基因的方法，目前已在国内外广泛应用。马蕾[4]将烟曲霉高度特异的碱性蛋白酶基因片段设计为种特异性探针，5′-端标记地高辛，检测出临床常见的烟曲霉和黄曲霉的感染。Hanazawa[5]采用原位杂交技术检测，结果证明用568-bp探针可以在感染中特异性检测到烟曲霉，该技术可适用于临床用于分子诊断烟曲霉感染的标本。

FISH是在放射性原位杂交技术的基础上，用荧光标记探针后检测，是一种非放射性的、对环境不构成污染的技术。由于可以同时使用多个探针并进行多色观察分析，因此大大缩短了检测周期并使过程简化，可以在细胞标本或组织标本上进行。本实验以曲霉菌的18SrRNA作为靶序列，参照文献设计了寡核苷酸探针18S-1.18S-1探针与烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉和灰绿曲霉等具有90%～100%的同源性，可以特异性地鉴定出临床绝大部分的致病曲霉菌，可协助临床进行迅速、准确的判断[6]。

曲霉病的诊断通常以组织病理学检查发现曲霉菌特征性的菌丝作为依据。Sangoi[7]为了评估真菌感染与培养组织学诊断的准确性，进行了10年的回顾性研究，总结了组织学和细胞学标本中真菌感染形态的鉴定，描述了较多经常被忽视的诊断问题，尤其是分枝的，有隔膜的菌丝组，如曲霉菌。虽然曲霉菌是常见的致病真菌，但并非所有这种分枝菌丝都代表曲霉菌。镰刀菌和皮肤癣菌都可以与曲霉菌具有相似的形态外观，但接受的治疗策略完全不同。Montone[8]使用双重荧光标记的寡核苷酸探针组成DNA和LNA的混合物，该测定能够区分石蜡包埋的组织切片中的曲霉菌和镰刀菌，而这两种真菌很难在组织学上准确直接区分。石蜡包埋的组织切片中这两种病原体都是透明、有分隔的分枝真菌，曲霉菌通常为45°角分枝，而镰刀菌为随机分枝，在组织中这种差异可能非常难以识别。虽然这两种病原体都会产生危及生命的感染，但由于镰刀菌和曲霉菌适宜的抗真菌药物并不完全相同，所以区分它们是至关重要的。在感染的病理组织中区别毛霉菌和曲霉菌的菌丝也并不容易。例如，曲霉菌菌丝有时可呈囊性扩张，而当毛霉菌的菌丝较狭窄，并能在菌丝内见到少数中隔时，通过形态学鉴定更为困难。鼻腔毛霉菌病是最富有暴发性的，可通过组织迅速播散，菌丝常侵犯血管壁并长入管腔，引起阻塞性血栓，加速感染的播散和相应组织的梗死，严重者可累及鼻、眼和大脑，常导致死亡，因此早期确诊病原菌的意义重大。本研究用FISH技术检测了50例石蜡包埋标本，其中有32例呈阳性反应，可以确定为曲霉菌。同时也提示了其他18例阴性患者可能为其他真菌种属感染。

Hayden等[9]设计了用于检测5种真菌生物的18SrRNA和28SrRNA序列的探针，对每种真菌都具有高度的特异性。这5种真菌包括了皮炎芽生菌、球孢子菌、新生隐球菌、组织胞浆菌和申克氏孢子丝菌，均在组织学上表现为圆形酵母状结构。通过原位杂交技术可以特异性地检测出不同的真菌，为组织切片中酵母样菌的鉴定提供了一种快速、准确的技术。它的主要优势在于能够准确鉴定出极少量、或不典型的病原菌。Oliveira[10]发现的都柏林念珠菌是一种传统上被鉴定为白念珠菌的单独物种，他设计了针对白念珠菌和都柏林念珠菌的rRNA的肽核酸(PNA)探针，并将它们应用于肽核酸-荧光原位杂交方法(PNA FISH)，用于鉴别白念珠菌和都柏林念珠菌。康俞莉[11]探讨FISH用于诊断小鼠皮肤中型无绿藻感染模型的可行性，通过FISH成功检测出了小鼠皮肤中型无绿藻感染模型组织中的无绿藻病原体，结果与PAS染色和HE染色一致。

与其他常规方法诸如直接镜检、真菌培养、组织病理、PCR等比较，本研究的创新点和临床意义在于：①利用了石蜡切片，避免反复取材给患者带来的痛苦；②所需时间短，可达到快速诊断的目的；③PAS、六胺银和真菌荧光染色仅能提示是否有真菌感染，但却不能鉴定是何种真菌感染；④本法是DNA的特异性扩增技术，可以直接鉴定曲霉的种属；⑤可利用存放多年的石蜡切片，实验所需用切片标本量少，不影响蜡块的保存和重复使用。

在FISH技术操作过程中蛋白酶消化是实验的关键环节[12]，若在此步骤处理不当，会影响最终结果。所以组织进行酶消化后应在显微镜下观察，控制好酶消化的程度。FISH可检测出石蜡包埋组织中的曲霉菌感染，也可以推广检测血液、分泌物或新鲜组织等其他各种临床标本。这样可以尽早和准确地诊断出致病真菌，合理选用抗真菌药物。