辛海云，孟繁明，胡斌，李宝红，杜宗亮，2*，李剑豪*

(1. 广东省农业科学院动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,广东 广州 510640；2. 清远市龙发种猪有限公司/广东省种猪育种工程技术研究中心,广东 英德 513057；3. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心,广东 茂名 525000

现代化的养殖业以集约化和规模化为特点。发情鉴定在家畜的繁殖管理中具有重要作用，通过发情鉴定可以准确及时的判断家畜的发情状态，确定最佳配种时间，保证家畜有较高的受胎率、产仔数和繁殖性能，并及时淘汰繁殖性能低下家畜，提高经济效益。目前生产上常用的发情鉴定方法包括观察法、试情法、激素法等，以及结合发情鉴定辅助监测设备等数字化鉴定系统[1-2]。这些方法各有利弊，鉴定结果准确性参差不齐，寻求灵敏、高效且对牲畜无创的新型发情鉴定方法仍是一项对生猪生产具有科学指导意义且市场应用前景广阔的前沿课题。

发情鉴定新型方法的探索在各种家畜中都在不断进行。蛋白、类固醇、电解质素等许多生物分子合成都会受到动物发情的调控，且在卵泡生长发育调节中发挥重要作用。血液[3]、尿液[4]、唾液[5]、子宫颈阴道黏液[6]等各种体液中生物分子表达差异成为母畜发情诊断的重要靶标。

唾液中的成分包括唾液腺(颌下腺、舌下腺、腮下腺)的分泌物，牙龈液和口腔微生物区系[7]。其分泌物包括了缓冲液，盐，核酸，有机物和蛋白[8-9]。唾液的存在有利于多种生物学功能，如润滑口腔，有助于咀嚼和吞咽，保护口腔组织和牙齿，唾液中的蛋白酶使口腔成为最早起始消化的器官。唾液的成分和性质会因各种动物的饮食偏好不同而变化[10-11]。

唾液相对于尿液和血液等体液，具有采集方便、分析样品量充足、成本低、稳定性强、无创且对动物应激小等特点，在家畜生理健康、疾病监控和早期诊断方面具有重要的生物学意义。近年来，通过生物镜检、PCR、色谱-质谱分析、气相色谱-质谱分析、蛋白质组学和生物信息学分析等先进技术手段，从发情周期不同时间点家畜唾液中筛选特异性发情标志物作为分子靶标，在新型高效家畜发情诊断技术的研究方面逐渐增多。本文将从唾液晶体形态、反转录、蛋白组成等方面分析唾液在发情鉴定中的应用，为服务我国的畜牧生产实践提供理论和技术支持。

1 利用唾液的晶体结构差异进行发情鉴定

唾液羊齿状结晶就是发情期母畜唾液在载玻片上涂布干燥后形成的羊齿状结晶。羊齿状结晶模式在唾液、宫颈黏液、眼泪和鼻黏液都能观察到。相比其他体液，唾液在任何时期都容易获得，且唾液腺是雌激素的一个目标组织[12]。体液晶体形态的周期性改变与雌激素和孕激素的分泌密不可分[13]；雌激素有助于结晶形成，而P4抑制这一结晶。唾液羊齿状结晶主要是排卵前由于高浓度的盐和黏膜对于高水平雌激素的响应而引起。这些结晶体是NaCl[14]。其形成是由于黏蛋白(mucine)的存在，其他电解质类、蛋白和碳水化合物也是结晶形成过程中必不可少的物质。

阴道或子宫颈黏液结晶体检测法最早是在女性上应用报道[15]。许多市面上销售的女性用排卵检测试剂盒就是基于排卵阶段女性唾液中形成羊齿状结晶而进行判断，使得女性自行检测排卵期更加简便和廉价。类似的检测在畜牧业中应用较少。以水牛为例，其子宫颈阴道黏液在安静发情状态下缺乏明显的黏液分泌，RAVINDER等[16]系统研究了水牛发情周期的唾液晶体形态，发现发情期其羊齿状晶体形态明显，在其他时期则表现不同的结晶形态，基于唾液羊齿状晶体形态进行发情鉴定的准确性可高达80%，极显著高于野外状态下判定的准确性(50%)，因而可以与其他方法结合进行综合评定。通过观察唾液晶体形态还可以实现在对牛、骆驼、狗等许多动物的妊娠诊断和配种[17-18]。

相对于超声波法、激素法、组化法等检测方法，唾液结晶法不需要太复杂的实验室条件和设备，样品随时可以获取，人员经费消耗少，可以简单快速鉴定发情，是适合小规模养殖场使用的理想方法。其准确性在不同研究中结果不同，需要结合畜牧场实际进行合理评估，或者通过与其他判定方法结合使用，提高鉴定准确率。

2 利用唾液的蛋白组学差异进行发情鉴定

唾液的成分随生理状态和环境的不同而波动较大，唾液蛋白表达谱在不同生理病理状态下存在较大差异，因而可以用于疾病的检测。蛋白具有稳定性强、获取方便、对动物无创等特点，因而蛋白标记物在许多不同目的的诊断中都有涉及[7]。相关文献在口腔疾病方面报道尤其较多，但在发情周期内表达差异方面的报道在近几年才逐渐兴起。

利用蛋白质组学方法分析母畜发情周期不同阶段唾液蛋白质表达差异，以寻找标记蛋白，其分析技术手段包括基于2D凝胶电泳联合基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)和四级飞行时间质谱，以及LC联合电喷射离子化飞行时间质谱(ESI)-TOF MS进行个体本身或者不同个体间的全唾液成分差异分析[7]。根据质谱结果进行venn diagram分析，寻找发情期特异表达蛋白，并通过Western Blot等方法进行验证。利用GO分析及功能注释、细胞通路分析等生物信息学分析方法绘制功能图谱，并对相关调控通路注解，探索特异表达蛋白在发情中的功能，以寻找特异蛋白标记物进行发情鉴定

基于以上研究思路，MUTHUKUMAR[7]等采用凝胶电泳结合LC-MS/MS建立了水牛整个发情周期的全唾液蛋白表达谱。SDS-Page共分离得到12个蛋白条带，分子量范围为14.5-120 kDa，这与其他报道中牛的唾液蛋白条带数相同[19-20]。质谱结果显示整个发情周期共有179种蛋白，其中37种蛋白是发情期特异表达。经过免疫印迹验证，β-烯醇酶和TLR-4在发情期确实特异表达。功能注释显示它们在发情期主要发挥结合蛋白的功能。利用同样的研究方法，该团队在子宫颈黏液发现68种发情期特异性表达蛋白。相似的研究在SHASHIKUMAR[21]的团队研究中也有报道，该团队共筛选得到62种发情期特异表达蛋白。两个团队在水牛唾液中寻找到的差异表达蛋白种类有其共同点，但大部分蛋白种类存在较大差异，这可能是由于两者发情阶段划分以及质谱分析方法的不同导致。

利用蛋白组学研究母畜发情周期唾液蛋白种类的方法可以为研究筛选和鉴定母畜唾液发情期特异表达蛋白提供新的研究思路和方法手段。然而，大部分研究中发情期特异表达蛋白的后续验证不足，并且如何将这些差异蛋白利用到发情鉴定中仍需进行深入研究。

3 利用唾液的挥发物差异进行发情鉴定

唾液中包含多种挥发性化合物，这些挥发性化合物按照一定的比例相互作用才能发挥化学信号的作用[22]。经过乙醚等有机溶剂萃取后经气相色谱-质谱联用分析(GC-MS)，可筛选得到发情期特异性的化学信号。

SANKAR等[23]利用这种方法在母牛唾液中筛选得到三甲胺，乙酸，苯酚，戊酸和丙酸等发情期特异性的化合物，后续的行为分析发现三甲胺可以吸引雄性动物，因而可以作为一种潜在的发情期特异性的唾液化学信号。类似的方法，KARTHIKEYAN等[22]使用气相色谱分析水牛繁殖周期中的唾液成分，共发现11种化合物。其中，P-cresol(对甲酚)是3种发情期特异性化合物之一。比较P-cresol与两种气味结合蛋白(OBP)和Beta-乳球蛋白之间的作用模式，发现OBP稳定性强，与P-cresol具有很强的亲和力，氢键相互作用分析显示OBP在唾液中负责信息素(pheromone)的释放。系统发育分析显示牛类的OBP属于独立的分支。其中P-cresol是一种异性吸引剂，相对其他类型的甲酚，其诱导公马的勃起水平最高。因此P-cresol可以作为水牛潜在的生殖状态标记物。而P-cresol在粪便中也存在，而且可以调节动物行为。在母马中，P-cresol是一种有效的挥发性排卵化学标记物，它是哺乳动物的尿液中一种天然存在的化合物。

基于唾液中挥发性化学成分的存在，结合犬类动物灵敏的嗅觉，可以对其进行训练，以识别发情时母畜牛奶、尿液、血液等体液中挥发性物质所散发的气味，成为发情探测犬，短时间集中训练即可达到较高的准确率(>80%)。相对其他体液，利用探测犬对奶牛发情周期唾液气味检查的准确率表现稍差，范围在40%～75%[24]，这可能是由于唾液中挥发性物质的浓度较低，而探测犬的训练强度不足。

这种发情相关的挥发性成分的发现为发情检测新技术带来了一线希望，使简单、无创的场地发情检测方法成为可能[22]，但利用唾液挥发物进行发情监测的方法技术仍需完善，其准确率也有待提高。

4 利用唾液中胞外RNA的差异进行发情鉴定

在多种生物标记物中，胞外RNA的重要性正在逐渐显现[25]。唾液中胞外RNA在人类临床诊断，尤其是人类癌症的诊断方面应用较广[26]。研究表明用未经RNA分离的原始唾液进行转录分析可用于临床诊断分析[27]。然而这项诊断应用方法在各类牲畜生理状态检测方面仍然不能得到有效应用，相关报道也很少。ONTERU等[25]探索了应用水牛唾液进行直接转录方法寻找发情期唾液RNA标记物的可行性。将水牛唾液去掉细胞和悬浮物质后不经RNA提取，直接用于RT-PCR获得发情标记蛋白目的基因片段后进行实时定量分析，随后采用非参数Mann-Whitney U检验，显示HSP70和TLR4在发情期的表达量显著高于间情期。因此直接应用未经RNA分离的原始唾液进行RNA转录分析可以作为一种简便鉴定反刍动物发情期唾液RNA标记物的方法。

在应用唾液进行直接反转录PCR前，引物设计需要注意在mRNA序列外显子-外显子的边界处，以防扩增到唾液中的DNA。这种方法需要大规模的生物组学分析为前提，以提供可能的发情期唾液新型RNA标记物，且该技术在其他哺乳动物上的应用是否可行仍需进一步探索。

5 利用唾液中的电解质平衡差异进行发情鉴定

发情周期中激素浓度不断变化，由此而引发的体液中相关物质物理特性和生物化学组成的周期性改变可以被用来判定发情周期的不同阶段。在排卵期，唾液中的许多电解质如Na、K、Mg、Cl、无机P的浓度会出现波动。这些生理学的改变主要是由于卵巢激素浓度变化而引起，如雌激素和孕酮的浓度随发情周期进程而改变。

卵巢激素对水平衡和电解质平衡的影响及其相关性研究在文献中已经有所报道[28]。雌激素导致肠道中Ca的摄入显著上升，而Ca排出明显受抑制[29]。此外，女性唾液羊齿状晶体形成跟排卵期一致，这是由于受雌性激素的影响唾液中的NaCl周期性的增加[14]。孕酮有促进尿钠排泄的效果，而且排卵后孕酮浓度的升高会引起醛固酮浓度的补偿上升和随后Na,K,Ca等一系列电解质浓度的改变。Mg具有调节月经周期的功能，而且基础代谢会发生改变。

DEVI等[30]测定了Murrah 水牛发情周期不同阶段唾液中无机物(包括钙、无机磷、镁、钠、钾、氯)浓度比例的变化情况，发现这些矿物元素的浓度在发情阶段比其他阶段显著提高。所有矿物质元素的浓度与血浆中雌激素的浓度呈显著正相关，而Ca, Mg, Na、Cl的浓度跟血浆中孕酮的浓度呈显著负相关。这与JOHNSON等[31]对于发情期阶段狗中的电解质平衡相关的研究结果类似。这些结果说明唾液中的矿物质浓度和电解质浓度在发情周期的不同阶段是变化的，这些结果可以用来辅助发情鉴定。

利用唾液理化性质和电解质组成变化特点辅助发情，其相关研究仍需增加动物样本量来验证结果的准确性。同时，研究发情期唾液电解质模式的改变或许为利用无创生物学体液来理解乳制品生产动物其普遍存在的矿物质缺乏症状等繁殖障碍疾病与机体多种繁殖激素之间的相关性研究提供新思路。

6 结论

综上，唾液作为一种获取简便的体液，在发情鉴定中具有多重优势，是进行无创生物标记物筛选的理想工具和提高牲畜发情鉴定效率和准确性的优良媒介，因而其在动物发情鉴定中应用前景广泛。然而目前应用唾液进行发情鉴定的方法多数集中在实验室研究阶段，筛选到的生物标记物需要大量的生物样本量来进行验证，相关产品的研发也需同步进行，使唾液发情鉴定方法更加普及。生产中需根据养殖场实际情况合理选择一种或多种方法，将唾液检测方法和其他方法有机结合，提高发情鉴定准确率，使牲畜繁殖性能得到充分发挥，提高生产效益。