胡一冰，罗 虹，潘春晖，王璐瑶，先文杰，闫博文，张文慧,徐玉玲

(1.成都大学 药学院，四川 成都 610106；2.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106;3.四川德成动物保健品有限公司，四川 德阳 618100)

0 引 言

六味地黄系列制剂(Liuwei Dihuang series preparations，LDSP)由熟地黄等3味补药及泽泻等3味泻药组成，为传统滋阴补肾的名方剂，以此为基础开发的多种剂型中成药广泛用于临床中，有免疫调节、抗氧化、降低血糖及抗肿瘤等多种药理效应[1-2].

目前各级标准中收载的六味地黄制剂有包括胶囊在内的11种剂型，临床应用主要以丸剂(大蜜丸、浓缩丸)、胶囊剂(胶囊、软胶囊)、颗粒剂及口服液为主，这些剂型虽然处方相同，但生产工艺有异，所含的物质基础可能有较大的区别，质量标准与控制水平也参差不齐.紫外、红外及近红外光谱法分别是在确定中药化学成分、反映中药中具有不饱和化学键及其共轭体系基本物质的吸收情况、反映中药中多种化合物成分饱和键的吸收、确定该中药中各种化学基团的基础上，对中药整体进行质量控制研究.本研究建立统一的紫外、近红外及红外光谱研究方法，对LDSP的质量进行整体评价，以期对其质量控制提供参考.

1 仪器与材料

1.1 仪 器

TU-1810PC型紫外可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限责任公司)；Spectrum Two 型傅里叶变换红外光谱仪(美国Perkin Elmer公司)；FA2004型分析电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；NIR Magic3500型近红外光谱分析仪(北京伟创英图科技有限公司)；PS-40型超声波清洗器(深圳得康清洁设备有限公司).

1.2 材 料

水为实验用纯净水；乙酸乙酯、甲醇、石油醚及二甲苯均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司；六味地黄丸(批号17012482、17011166、17012473，编号 S1、S2、S3),六味地黄(浓缩丸)(批号18073459、18074529、18071341，编号 S4、S5、S6),六味地黄软胶囊(批号18170316、18170314、18170319，编号 S7、S8、S9),购自北京同仁堂科技发展股份有限公司；六味地黄胶囊(批号20180516、20170621、20171014，编号 S10、S11、S12),购自修正药业集团股份有限公司；六味地黄颗粒(批号20170604、20170607、20171001，编号 S13、S14、S15),购自保和堂制药有限公司；六味地黄口服液(批号170803、180106、170801，编号 S16、S17、S18),购自黄山市天目药业有限公司.

2 方法与结果

2.1 LDSP紫外光谱研究[3-6]

2.1.1 光谱扫描条件

以水为空白调零，扣除基底影响；光谱宽带为2.00 nm,扫描范围为200.00～800.00 nm,光度模式为Abs，扫描间隔为1.0 nm，扫描速度为快.

2.1.2 供试品溶液制备

1)六味地黄丸供试品溶液制备.取样品S1、S2、S3适量，剪碎，按照相同生药量各取2.4 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，分别加入水25 mL，精密移取，密塞，超声提取(30 ℃，300 W,50 Hz)30 min，放冷，摇匀，抽滤，取滤渣重复上述操作，合并此2次续滤液，并取适量用0.45 μm微孔滤膜，精密移取1 mL续滤液置于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得稀释50倍的供试品溶液；分别取上述生药量下六味地黄丸(浓缩丸)、六味地黄胶囊及六味地黄颗粒，同上述方法操作，制得供试品溶液.

2)六味地黄软胶囊供试品溶液制备.取样品S7、S8、S9内容物，按照六味地黄处方生药量相同，各取0.62 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，加入石油醚(30～60 ℃)30 mL，加热回流1 h，50 ℃，放冷，倾去石油醚液，然后，照上述六味地黄丸供试品溶液制备方法分别加入水25 mL并继续同法操作.

3)六味地黄口服液供试品溶液制备.取样品S16、S17、S18，按照六味地黄处方生药量相同，各取2.7 mL,精密移取，分别置于具塞锥形瓶中，分别加入水22.29 mL，摇匀，然后照上述六味地黄丸供试品溶液制备方法抽滤并继续同法操作.

2.1.3 方法学考察

1)精密度实验.按“2.1.2”项下各制备同一供试品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.1.1”项下扫描条件各连续扫描6次.结果显示，300、290、277、249、240及230 nm处吸光度RSD均小于0.13%，表明仪器精密度良好.

2)稳定性实验.按“2.1.2”项下各制备同一供试品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，各分别于0、1、2、3、4及5 h，按“2.1.1”项下扫描条件进行扫描.结果显示，300、290、277、249、240及230 nm处吸光度RSD均小于2.50%，表明供试品在5 h内稳定性良好.

3)重复性实验.各取同一批次样品(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.1.2”项下方法各平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下扫描条件进行扫描.结果显示，300、290、277、249、240及230 nm处吸光度RSD均小于2.50%，表明该方法重复性良好.

2.1.4 紫外光谱采集

取“2.1.2”项下按照生药量相同制备的LDSP样品，按“2.1.1”项下扫描条件进行扫描，其紫外可见光谱叠加图如图1所示.由图1可知，LDSP在249 nm(波谷)与277 nm(波峰)都有强吸收，LDSP的吸光度整体值大小依次为大蜜丸、颗粒、浓缩丸、口服液、胶囊及软胶囊.

2.1.5 紫外对照光谱建立

将测得的不同制剂不同批次紫外图谱各波长下的吸光度取平均值，并以平均值建立对照光谱.

2.1.6 紫外光谱相似度分析

对6种制剂各3批样品的紫外对照光谱进行相似度分析，经数据处理软件IBM SPSS statistics中双变量相关“Kendall’s tau-b”分析计算相似度，如表1所示.分析结果显示，LDSP紫外对照光谱显著相关，相似度在0.833～0.985之间，其中大蜜丸和口服液相似度最高，而胶囊和软胶囊相似度最低(即为0.833)，表明LDSP间物质基础在200～400 nm吸收相似.

表1 LDSP紫外对照光谱相似度分析

2.2 LDSP红外光谱研究[7-9]

2.2.1 供试品溶液制备

1)六味地黄丸供试品溶液制备.取样品S1、S2及S3适量，剪碎，按照相同生药量各取1 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，分别加入水25 mL，精密移取，密塞，超声提取(30 ℃，300 W,50 Hz)30 min，放冷，摇匀，置高速离心机中离心(5 000 r/min)10 min，取上清液,用0.45 μm微孔滤膜滤过，用平头微量进样针移取20 μL续滤液于玛瑙研钵中，挥干，加入0.1 g干燥KBr，沿同一方向研磨均匀，取适量研细后的粉末平铺于红外压片磨具中，以10 MPa压力压制2 min，将制备好的样品置于红外光谱仪中测定，扫描范围为400～4 000 cm-1；分别取上述生药量下六味地黄丸(浓缩丸)、六味地黄胶囊及六味地黄颗粒，同上述方法操作，制得供试品溶液.

2)六味地黄软胶囊供试品溶液制备.取样品S7、S8及S9内容物，按照六味地黄处方生药量相同各取0.2 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，加入石油醚(30～60 ℃)30 mL，加热回流1 h，50 ℃，放冷，倾去石油醚液，然后照上述六味地黄丸供试品溶液制备方法分别加入水25 mL并继续同法操作.

3)六味地黄口服液供试品溶液制备.取样品S16、S17及S18，按照六味地黄处方生药量相同各取1.11 mL,精密移取，分别置于具塞锥形瓶中，加入水23.89 mL，精密移取，摇匀，照上述六味地黄丸供试品溶液制备方法置高速离心机中并继续同法操作.

2.2.2 方法学考察

1)精密度实验.取同一供试品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.2.1”项下的方法压片，各连续测定6次，计算所得红外光谱中各特征峰波数的RSD均小于0.79%，表明仪器精密度良好.

2)稳定性实验.取同一供试品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.2.1”项下的方法压片，各置于干燥器中保存，分别于0、1、2、3、4及5 h时扫描，计算所得红外光谱中各特征峰的波数的RSD均小于2.21%，表明供试品在5 h内稳定性良好.

3)重复性实验.取同一供试品溶液(S1、S4、S7、S10、S13及S16)，按“2.2.1”项下的方法，各平行压制6片，测定，计算所得红外光谱中各特征峰波数的RSD均小于2.73%，表明该方法重复性良好.

2.2.3 红外光谱建立

将“2.2.1”项下方法制备的供试品，进行压片并分别测定，LDSP样品(各3批)的红外光谱叠加图如图2所示.对6种制剂各3批样品的红外对照光谱进行相似度分析，经数据处理软件IBM SPSS statistics中双变量相关“Kendall’s tau-b”分析计算相似度，如表2所示.

表2 LDSP红外对照光谱相似度分析

分析结果显示：六味地黄红外光谱图的特征为在3 380、1 620及1 029 cm-1左右均有3个峰，且对各制剂，峰形均相似，第1个峰为大钝峰，后2个峰强度较前者小，较锐；大蜜丸、颗粒、浓缩丸、软胶囊及口服液在2 931、1 384及580 cm-1附近也都有峰，各图峰形彼此相似，且在1 029 cm-1强峰的左侧依次有2个肩峰，右侧有1个肩峰，峰相对强度不同，胶囊无；大蜜丸与颗粒在829 cm-1左右有至少2个小峰，呈肩峰状，且与其他制剂峰形不同.由图2可知，各制剂所含峰的相对强度不同，大蜜丸和颗粒相对较强，浓缩丸、软胶囊及口服液次之，胶囊相对较弱，表明LDSP间物质分子的特性存在不同且质量也存在差异.

相似度分析中，LDSP红外对照光谱相似度在0.309～0.887之间，其中大蜜丸和颗粒相似度最高，大蜜丸和胶囊最低(即为0.309)，大蜜丸与颗粒、浓缩丸具有极显著相关，与软胶囊具有显著相关，与口服液、胶囊为负相关.由此可知，LDSP间物质基础存在差异.

2.3 LDSP近红外光谱研究[10-11]

2.3.1 近红外光谱采集

近红外光谱分析仪开机预热30 min后，将LDSP(除口服液3批)直接放入样品杯中，进行扫描.扫描条件设置为：扫描次数32次，范围为900～1 800 cm-1,以仪器内置背景为参比.5种制剂样品的近红外叠加图谱如图3所示.经数据处理软件IBM SPSS statistics中双变量相关“Kendall’s tau-b”分析计算相似度，结果见表3.

表3 5种制剂近红外对照光谱相似度分析

由图3与图4可得，LDSP(除口服液外)在1 200、1 315、1 460、1 530、1 570、1 660及1 720 nm处都有吸收，但峰的相对强度和峰形有差异.其中，在1 200 nm处，软胶囊峰的相对强度较其他4种制剂强，且峰形也不同；在1 720 nm处，软胶囊、大蜜丸及颗粒峰的相对强度较浓缩丸和胶囊的强，前三者峰形基本相同，后两者峰形基本相同，且前三者和后两者峰形不同；在1 315、1 460、1 530、1 570及1 660 nm处5种制剂的峰形基本相同，但各制剂峰相对强度不同，大致为大蜜丸、颗粒及软胶囊较浓缩丸和胶囊强.由表3知，5种制剂近红外对照光谱相似度在0.401～0.898之间，其中大蜜丸和颗粒相似度最高；浓缩丸和软胶囊最低(即为0.401)，大蜜丸与颗粒、软胶囊呈极显著相关，与浓缩丸和胶囊呈显著相关，而软胶囊只与颗粒、大蜜丸呈显著相关.由此说明，5种制剂物质分子种类基本相同，但分子大小存在差异，质量不同.

2.3.2 近红外对照光谱建立

选择单个制剂(除口服液)3批次，以其吸光度值的平均值为对照光谱的吸光度，得到对照近红外光谱如图4所示.

3 讨 论

本研究建立紫外、红外及近红外光谱法来比较LDSP的质量差异，结合相似度分析，能从整体上对LDSP进行质量评价，为其质量标准提升提供了参考.

本研究在近红外光谱研究中曾考察过以水作为溶媒，将LDSP(各3批次)制备成溶液，进行近红外光谱扫描，结果LDSP样品的近红外光谱图与水相同，表明水对其有干扰.结合近红外光谱仪的自身特性，本研究采用直接扫描法对六味地黄系列制剂进行近红外分析.由于口服液剂型的工艺采用水作为溶媒，对口服液剂型的近红外光谱有待进一步研究，所以本研究在近红外光谱中只比较其他5种剂型。