,2

(1.广东省药品检验所,广东广州 510663;2.广州中医药大学,广东广州 510006)

明胶胶囊可容纳各种固体、半固体、液体,广泛应用于食品和药品中。为了避光或遮盖内容物达到美观效果,部分胶囊生产过程中会添加各种合成色素[1]。合成色素大多属于煤焦油合成的染料,不仅本身没有营养价值,且大多数对人体有害,主要包括一般毒性、致泻性和致癌性,表现为对人体直接危害,在代谢过程中产生有害物质或合成过程中带入的砷、铅等污染物[2-5]。鉴于此,世界各国对合成食用色素的使用种类、使用量及使用范围均有明确规定,并随着研究的深入不断地调整相应标准[6-7]。我国食品安全标准GB 2760-2014《食品添加剂使用标准》规定了允许作为食品添加剂的11种合成色素(柠檬黄、新红、苋菜红、靛蓝、喹啉黄、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红、亮蓝和赤藓红)的使用范围和使用量[8];而合成色素作为药用,虽然在现行的《中国药典》(2015版)没有相关规定[9],但国家药典会2018年公开征求意见的《胶囊(空心胶囊)通则》规定胶囊中允许添加的合成色素共有10种:柠檬黄、苋菜红、靛蓝、喹啉黄、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红、亮蓝和赤藓红[10]。

我国对胶囊中合成色素的使用有相应规定,却没有建立与之匹配的检测方法。GB 5009.35-2016只能检测柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红7种色素[11],SN/T 1743-2006只能检测诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄4种色素[12],喹啉黄的检测仅有地方标准[13]。为此,本文根据明胶胶囊的特点,改进前处理方法,优化色谱条件,建立一种能同时测定明胶胶囊中11种合成色素的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明胶胶囊 共20批，其中来自于2018年广东省监督抽验(辅料专项)4批，编号为样品3～6，来自于2018年国家保健食品监督抽验的抽验样品16批，编号分别为样品1、样品2、样品7～20;甲醇、乙腈 色谱纯,Honeywell公司;乙酸铵 GR,阿拉丁试剂公司;木瓜蛋白酶 酶活力≥6000 USPu/mg,E. Merck公司;新红 标品(1000 μg/mL),北京海岸鸿蒙标准物质技术公司;胭脂红 纯度98%,源叶生物科技生物有限公司;柠檬黄、靛蓝二磺酸钠、喹啉黄、日落黄、诱惑红、亮蓝 纯度分别为90.0%、86.0%、90.2%、87.0%、83.0%、92.3%,Dr. Ehrenstorfer公司;苋菜红、偶氮玉红 纯度分别为95.3%、90.7%,Manhage公司;赤藓红 纯度100%,中国食品药品检定研究院。

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪,配备二极管阵列检测器 美国安捷伦公司;SARTORIUS电子分析天平 德国赛多利斯公司;IKA磁力搅拌器 德国IKA公司;MILLIPORE超纯水发生器 美国密理博公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 标准储备溶液:准确称取适量固体标准品(按纯度折算),柠檬黄、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝配成2500 μg/mL标准溶液,苋菜红、靛蓝二磺酸钠配成2000 μg/mL标准溶液,喹啉黄、偶氮玉红、赤藓红配成1000 μg/mL标准溶液。

混合标准工作溶液:吸取配制好的标准储备液及购买的成品标准溶液,用水定容成各组分含量为100 μg/mL的混合标准溶液,使用时用纯水稀释成各组分浓度为0.5、25、50、75 μg/mL的标准系列,经0.45 μm滤膜过滤。

1.2.2 样品处理 弃去胶囊内容物,囊壳擦拭干净。取囊壳1.0～2.0 g于锥形瓶中,加0.01 g木瓜蛋白酶、水15 mL。将锥形瓶置于磁力搅拌器上60 ℃搅拌30 min,冷却后转入25 mL容量瓶,用水定容至刻度,过0.45 μm 微孔过滤膜,上机测定。

1.2.3 色谱条件 保护柱:Agilent Zorbax Eclipse XDB C18(4.6 mm×12.5 mm,5 μm);色谱柱:CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;进样量:10 μL;检测波长:柠檬黄、喹啉黄450 nm,新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红、赤藓红520 nm;靛蓝二磺酸钠、亮蓝620 nm;流动相:见表1。

表1 梯度洗脱表Table 1 Gradient elution procedure

1.3 数据处理

每组实验重复两次,采用Microsoft Office Excel 2007进行数据处理,采用Origin 9.0对数据作图,样品重复测定两次。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

食品安全国家标准GB 5009.35-2016采用聚酰胺吸附法对样品进行前处理,对含赤藓红的样品采用液-液分配法[11]。明胶胶囊成分简单,不含有干扰实验结果的物质,不需要按照GB 5009.35-2016方法对样品进行复杂的除杂提纯[14]。但如果直接将胶囊加热溶解后提取色素,由于明胶具有胶凝性,溶液冷却后难以过滤进行测定。已有学者对胶囊中色素的提取做过研究:刘泰然等[15]采用乙醇氨溶液漂洗浸泡囊壳直至色素提取完全,胡立立等[14]采用超声提取法,两种方法均耗时较长;王翀等[1]将明胶胶囊溶解后采用甲醇沉淀法除去明胶,整个提取过程步骤较多。本文以木瓜蛋白酶对明胶胶囊进行水解,明胶分解成能溶于水的多肽后,囊壳中色素即溶于水中,溶液冷却后也不再凝冻,过滤方便。该方法步骤少,方便快捷,色素损失少,并可进一步扩展用于提取明胶胶囊中其他水溶性色素。

本实验考察了酶添加量对色素提取的影响。以2.0 g胶囊壳为底物,分别加入0.001、0.005、0.010、0.020、0.040 g木瓜蛋白酶,60 ℃水解30 min。结果发现:加酶量0.001 g时,酶量过低,明胶水解程度不足,仍具有胶凝性,溶液冷却后成果冻状凝胶;加酶量增大至0.005 g时,溶液冷却后为粘稠液体;加酶量≥0.01 g时,溶液放置过夜后仍具有良好的流动性,无法形成凝胶。因此本方法选择令明胶无法凝冻的最低加酶量0.01 g。

2.2 检测波长的选择

色素混合标准溶液经C18柱分离后,由二极管阵列检测器于210～630 nm波长范围内扫描得紫外吸收光谱以确定各组分最大吸收波长,分别为柠檬黄428 nm、新红506 nm、苋菜红216 nm、靛蓝288 nm、喹啉黄412 nm、胭脂红216 nm、日落黄236 nm、诱惑红214 nm、偶氮玉红518 nm、亮蓝628 nm、赤藓红530 nm,同时苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、诱惑红分别在522、612、506、482、508 nm处也存在较强吸收。

该液相色谱方法的主要难点是喹啉黄和其他10种色素的分离。喹啉黄主要成分为喹啉黄一钠盐和二钠盐,同时各有两种同分异构体,在色谱图上存在4个主要的色谱峰,极易跟其他色素的色谱峰重叠[13,16-17]。如单独考虑最大吸收波长,柠檬黄、喹啉黄的最佳检测波长为420 nm。但实验发现,检测波长为420 nm时,亮蓝色谱峰位于喹啉黄第3峰和第4峰之间,分离度分别为1.97和1.40,未达到完全分离。最终将柠檬黄、喹啉黄检测波长确定为450 nm,在此波长下,柠檬黄和喹啉黄仍有一定强度的吸收,而亮蓝几乎无吸收(见图1),避免了亮蓝对喹啉黄的干扰。其他色素参考其最大吸收波长,综合考虑后选择520 nm为新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、偶氮玉红、赤藓红检测波长,选择620 nm为靛蓝、亮蓝检测波长。

图1 柠檬黄、喹啉黄和亮蓝光谱图Fig.1 Spectrograms of tartrazine,quinoline yellow and brilliant blue

2.3 流动相的选择

流动相的组成影响化合物的峰形和分离效果。实验表明,仅用甲醇或乙腈和乙酸铵混合为流动相难以实现待测物的分离,而这三者混合使用时效果更佳。参考GB 5009.35-2016及文献中流动相的梯度洗脱程序[11,18],对流动相溶剂种类、浓度等进行了调整,得到最佳梯度洗脱程序(见表1)。

乙酸铵由于水溶性好,所以常被用作缓冲溶液,但其浓度过高易造成仪器的腐蚀并清洗困难[14]。本文比较了10、15、20、25、30 mmol/L乙酸铵溶液对色素分离效果的影响。随着乙酸铵浓度的提高,喹啉黄1和胭脂红分离度逐渐减小,当乙酸铵浓度为20 mmol/L时,喹啉黄1和胭脂红分离度仅为1.4,不能完全分离;乙酸铵浓度为25 mmol/L时,喹啉黄1和胭脂红两峰明显已部分重叠。而某些峰呈现相反的趋势,如柠檬黄和新红、喹啉黄2和日落黄的分离度随着乙酸铵浓度提高而逐渐增大。最终选择乙酸铵浓度为15 mmol/L,在此浓度下各组分分离度均大于1.5,能实现基线分离。

关于流动相的pH,部分文献表示乙酸铵溶液需要调节至酸性来进行分离[19-21],而另一部分文献则表示无需调节pH就能获得良好的分离[11-14,22-23]。本文比较了在流动相溶液pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH6.8及不调节溶液pH(pH6.3)时各组分分离效果,发现随着pH的升高出峰时间变短,最先出峰的柠檬黄提前0.08 min,最末出峰的赤藓红提前0.5 min。由于各色谱峰出峰时间整体前移且变化幅度最高仅2%,pH的变化最终对各峰分离效果影响不大,故不调节流动相pH。

2.4 标准曲线及方法检出浓度

取浓度为0、0.5、25、50、75、100 μg/mL混合标准工作溶液上机测定,以色谱峰面积对其质量浓度(μg/mL)进行线性回归。稀释混合标准工作溶液至低浓度上机测定,以信噪比(S/N)3～5确定样品的检出限。11种色素的检出限为0.3～2.5 mg/kg,在0～100 μg/mL线性范围内,相关系数r大于0.999,表明各化合物均具有良好的线性关系。混合对照品的液相色谱图见图2,线性回归方程、相关系数、方法检出浓度如表2所示。

图2 100 μg/mL混合对照品溶液色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of 100 μg/mL mixed reference solution注：A～C分别为450、520、620 nm的色谱图。

表2 11种色素的线性回归方程、相关系数和方法检出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and limit of detection concentration of 11 kinds of pigments

表3 回收率和精密度测定结果Table 3 Recovery rate and precision determination results

2.5 方法精密度和回收率

取未添加色素的胶囊壳样品2 g作为本底,精密加入不同浓度混合标准溶液,按“1.2.2”节下方法制备供试品溶液进行回收率和精密度试验。选取高中低三个加标水平,低浓度加标水平为12.5 mg/kg,中浓度加标水平为125 mg/kg,高浓度根据各色素最大允许使用量,加标水平选择250～1000 mg/kg进行回收试验,结果如表3所示。该方法精密度为0.2%～1.7%,回收率为79.1%～119.3%。结果表明,本方法能够满足检测要求。

2.6 实验样品测定结果

采用上述方法对收集的20批样品进行检测,检测结果见表4。如参照《胶囊(空心胶囊)通则》(征求意见稿)的要求：着色剂添加总量原则上不超过空心胶囊总重量的0.5%[10],有4批产品不符合要求,这4个批次均来自于2018年国家保健食品监督抽验的抽验样品，样品编号分别为11、16、17、19。

表4 样品中色素含量(mg/g)Table 4 Contents of synthetic pigments in samples(mg/g)

3 结论

本研究通过对仪器色谱条件的优化,以及针对样品特点对前处理方法的改进,建立了明胶胶囊中11种合成色素的高效液相色谱分析方法。该方法前处理简单,检测效率高,同时回收率高、结果准确,可作为明胶胶囊中合成色素的常规检测方法。在当今食品药品质量安全备受重视的环境下,该方法弥补了明胶胶囊中合成色素检测方法的空白,可以为企业以及监管部门控制胶囊质量提供技术支持。