韦汝珍

（柳州市工人医院，广西 柳州）

0 引言

Kirston-ras癌基因(简称K-ras基因)在直肠癌（cancer of the rectum，CRC）的发生发展中起重要的作用，越来越多的研究表明，西妥昔单抗（Cetuximab，C225）治疗K-ras基因野生型结直肠癌患者敏感，而对突变型无效。因此，检测K-ras基因状态对指导结直肠癌患者靶向治疗十分重要。我们通过实验统计K-ras基因的总体突变率，为结肠癌患者的基因诊断，个体化治疗的开展提供一个数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集

收集2011年1月至2013年12月的 375例结直肠癌石蜡组织标本。通过检测结肠癌患者K-ras基因状态统计其突变率。所有检测均取得患者的知情同意。

1.2 引物设计与合成

PCR及测序引物，采用PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸测序仪（瑞典Biotage AB公司产）配套的引物分析软件进行设计，由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR上游引物为ATGACTGAATATAAACTTGTGGTA，下游引物为Biotin-TTGGATCATATTCGTCCACAAA，PCR扩增片段为103bp，测序引物为TTGTGGTAGTTGGAGCT。

1.3 PCR扩增

按照GTpure FFPE组织DNA提取试剂盒操作步骤，从石蜡切片中抽提基因组DNA，试剂盒购自基因科技（上海）有限公司。具体实验步骤如下：切取10片石蜡切片样本，放入 1.5 ml 离心管内；向离心管内加入1.2 ml 二甲苯，漩涡震荡，12000 rpm 离心5 min；弃上清液，加入 1.2 ml 无水乙醇，震荡混匀，12000 rpm 离心 2 min；弃上清液，打开管盖在室温或 37℃晾干残留的乙醇；加入 180 μl DR Buffer，20 μl Proteinase K，充分混匀，56℃消化完全至没有可见组织块；加入300 μl 的GDT Buffer，充分混匀后，70℃孵育10 min；加入300 μl 的无水乙醇，震荡混匀。待冷却到室温后，加入到离心柱内，8000 rpm，离心1 min，弃收集管内滤液；向离心柱内加入 500 μl PW Buffer，8000 rpm离心30 s，弃滤液；向离心柱内加入 600 μl WA Buffer，8000 rpm离心30 s，弃滤液；弃滤液后，12000 rpm 离心2 min，将离心柱放入新的1.5 ml 离心管内；向离心柱内的膜中央加入 40-80μl 预热的DE Buffer，室温放置2min，8000 rpm 离心2 min。弃离心柱，即得提取好的DNA。

PCR扩增K-ras基因的相关片段（PCR扩增仪型号是ABI Veriti 96孔梯度PCR仪）: 按照PCR扩增试剂盒实验步骤进行PCR扩增，PCR扩增试剂盒购自基因科技（上海）有限公司，主要步骤如下:采用50μl反应体系，其中10×PCR buffer 5μl，2.5mM dNTP 4μl，10mM上 游 引 物F1 1μl，10mM下 游 引 物Biotin-R1 1μl，1UTaq酶0.5μl，ddH2O 36.5μl，最后加入样本模板2μl，总反应体系为50μl，PCR反应条件为：95℃ 3min，然后95℃ 10s，56℃ 20s，72℃ 30s，共45个循环，最后72℃ 5min。PCR反应结束后，选择性地对PCR产物进行Agarose电泳分析，以验证PCR扩增效率。

1.4 焦磷酸测序

1.4.1 采用PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸测序仪（瑞典Biotage AB公司产）配套的单链纯化装置从PCR反应液中分离单链DNA。

1.4.2 将测序反应板放置于测序仪中进行测序。

1.4.3 数据分析：采用焦磷酸测序仪配套的分析软件进行，首先进行SNP分析，对于存在杂合子的位点，需进一步进行基因频率分析。

备注：Pyrosequencing焦磷酸测序实验委托基因科技（上海）有限公司完成。

1.5 统计学处理

采用SPSS16.0统计软件，χ2检验分析数据。

2 结果

2.1 K-ras基因PCR扩增结果

见图1。

1: 野生型；2: 12密码子突变；3: 13密码子突变 ；M：marker

图1 K-ras基因PCR扩增结果

2.2 测序结果

K-ras基因12、13密码子突变情况测序如图2所示。

图2 野生型、突变型图谱

375例患者组织标本总共突变121例，其中12号密码子GGT突变为GTT 42例，占突变人数的 34.71%，突变为GAT 54例，占突变人数的44.63%，突变为AGT、CGT、TGT、GCT 7例，占突变人数的 5.79%；13号密码子GGC突变为GAC 17例，占突变人数的14.05%，突变为TGC 1例，占突变人数的0.83%。K-ras总体突变率为32.27%。

3 讨论

K-ras是一种原癌基因，编码K-ras蛋白，参与细胞内的信号传递，当正常时（即野生型）能调控细胞生长的路径；K-ras基因突变后，编码不正常的K-ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡，细胞增殖失控而癌变。刘影等[1]的研究发现k-ras基因参与结直肠癌的发生、发展。马其钊等[2]、吴文辉等[3]的研究报告得出，结直肠癌中K-ras基因突变与肿瘤分化程度有相关性，而与患者年龄、性别、肿瘤浸润深度及是否有淋巴结转移无关。说明K-ras基因突变是CRC的早期事件。CRC患者的K-ras突变很常见，欧美国家的突变率为30%-60%[4,5]。2006年，Lièvre等[6]首先报道CRC的K-ras野生型患者对C225敏感， Normanno N[7]做了进一步验证，得出K-ras突变型CRC患者无法从C225治疗中获益，反而增加了药物的毒性。随后大量的临床研究证实，病理标本检测表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为野生型的CRC患者使用C225有很好的疗效。在美国，治疗使用C225前，必须首先检测K-ras基因状态[8,9]，若K-ras为突变型则不建议靶向药物，从而避免对人体的毒性。因此，检测CRC患者是否存在K-ras基因突变，可实现CRC患者的个性化用药治疗。

我们通过实验筛查，统计K-ras基因的总体突变率，得出结直肠癌的K-ras基因的总体突变率为32.27%，无明显的南北差异。为结肠癌患者的基因诊断，分子靶向的个体化治疗提供一个数据参考。根据前人[10,11]报道的研究结论：K-ras基因突变，尤其是12号密码子，易引起癌症的复发转移，我们的统计也显示出12号密码子的突变占很大比例，检测K-ras基因的状态可评估结肠癌患者的复发转移风险，为将来选择最佳治疗做好准备[12]。筛查 CRC患者K-ras基因，实现对CRC患者更合理的用药。