于海英，吴昊，黄瑞芬，王蛟，张睿轩，宋玉双

(1.国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站，林业有害生物监测预警国家林业和草原局重点实验室，辽宁沈阳 110034；2.辽宁省林业有害生物防治检疫工作站，辽宁沈阳 110084；3.清原县苍石林场，辽宁清原 113200)

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus在我国是危害极大、危险性极高的外来有害生物。 近年来，松材线虫在辽宁扩散蔓延过程中不断危害红松Pinus koraiensis、落叶松Larixspp.等新寄主[1-2]。 樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica是我国北方尤其是干旱地区的主要造林树种，因其具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、适应性强、生长快、材质好等特点，引种栽培范围不断扩大，己成为我国北方营造用材林、防护林、固沙林、四旁绿化和荒山造林的主要树种。 樟子松是欧洲赤松Pinus sylvestris的一个地理变种，国外资料曾记载松材线虫可危害欧洲赤松[3]，我国曾有接种试验表明樟子松人工接种可感染松材线虫[4-6]，但未曾报道樟子松为松材线虫自然感病寄主。 2019 年4—7 月，笔者对辽宁省抚顺市樟子松枯死情况进行了调查及病原线虫检测，发现枯死樟子松树体内存在松材线虫，且树体内线虫量较大，发病病程较快。 笔者首次报道我国樟子松在自然条件下感染松材线虫，并对相关问题进行讨论。

1 材料与方法

1.1 样地概况 2019 年4—7 月，在辽宁省抚顺市清原县红透山镇红透山村2 林班10 小班(E 124°31′38"，N 41°59′38")邻近的 2 个山坡的樟子松纯林，林龄44 a，进行调查。 1)半截沟水源涵养林，面积2.5 hm2，坡向东，坡角 16°；2)小北沟水源涵养林，面积1.9 hm2，坡向南，坡角20°。

1.2 病树取样 共采集30 株感病樟子松样本，用于分离鉴定病原线虫。

1.2.1 主干取样 伐倒木在主干上部取样，截取3 cm厚圆盘；立木在离地1.2 m 处用砍刀将树皮削掉，砍取木质部碎片，深度超过1 cm，装入标本袋。

1.2.2 病枝取样 通过锂电高枝锯剪取病死枝，装入标本袋。

1.3 线虫分离 采用贝尔曼漏斗法。 将采集木样劈成火柴棍大小，单层纸巾包好，纯净水浸泡24 h漏取约2 mL 线虫悬浮液放入离心管中，静置0.5 h，吸取管底线虫液用于形态鉴定和分子鉴定。

1.4 形态鉴定 用100 μL 移液枪吸取离心管底部线虫悬浮液滴至载玻片，在体视解剖镜下用10 μL移液枪分别挑取线虫雌、雄成虫各1 头以上，将其置于酒精灯火焰上方加热3 ～5 s，线虫热杀死后加盖玻片，制成临时玻片，在显微镜下观察线虫形态特征并进行鉴定。 未见线虫成虫虫态的用10 μL 移液枪挑取线虫幼虫100 头接种到灰葡萄孢菌培养基上，25 ℃培养箱培养5 ～10 d，待灰葡萄孢菌丝被取食完毕，用蒸馏水将线虫洗出获得线虫成虫；部分木样充分吸水后于30 ℃恒温培养72 h[7]。 重复1.3 步骤分离直接获得线虫成虫。

用Zeiss Imager Z1 显微镜和Axioscop MRm 数码相机对线虫的整体形态和内部特征进行观察、拍照。 取雌、雄成虫各20 条，测量其体长(L)、体长/最大体宽(a)等数值，通过 Excel 中 AVERAGE 和STDEVP 函数得出平均数与标准差。

1.5 分子鉴定 单条线虫DNA 的提取参照王江岭 等[8]的方法，提取7 条线虫的DNA，核糖体ITS基因扩增引物对为 F194 (5′ CGTAACAAGGTAGCTGTAG 3′)和 5386r (5′TTTCACTCGCCGTTACTAAGG 3′)[9]，PCR 扩增产物送上海美吉生物科技有限公司双向测序。

使用ChormasPro 软件对ITS 基因测序得到的双向峰图文件进行拼接，去除测序结果两端的低质量序列。

登陆NCBI 网站中的BLAST(basic local alignment search tool) 页面( https:/ /blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对。 在 Basic BLAST 中选择 nucleotide blast，在 Enter Query Sequence 中粘贴需要鉴定的序列，点击左下角 BLAST。 在网站中下载已登录的各近似种的部分序列，选用Maximum Composite Likelihood 模型、Bootstrap 值 1 000，用MEGA 6 构建Neighbor-Joining 系统进化树。

2 结果与分析

2.1 枯死樟子松病原线虫分离结果 调查的30 株樟子松中22 株有松材线虫，有线虫株率73.3%。1、4、6、7、9、10、11、14、15 号树针叶变红褐色未脱落，为当年枯死的樟子松，木样充分分离松材线虫后，将木样烘干，测算线虫密度平均为1 294 条/g，线虫量较多，且较纯。 17、20、21、22、24、25 号树枯死时间较长的樟子松中松材线虫数量较少，腐生线虫较多。 2、3、5、12、18、23、27 号树部分枝条枯黄的樟子松在主干部位取样通常分离不出松材线虫，在枯死枝条部位可分离出大量松材线虫(表1)。

表1 辽宁抚顺枯死和濒死樟子松上线虫分离情况Tab.1 Separation of nematodes on the dead and dying Pinus sylvestris var.mongolica in Fushun，Liaoning province

续表1Tab.1(Continued)

2.1 线虫鉴定结果

2.2.1 形态观察结果 雌虫热杀死后虫体略向腹面弯曲，长约1 mm，宽约20 μm(图1A)。 唇区高，缢缩显著。 口针细长，基部略膨大。 中食道球卵圆形，占体宽的3/4 左右，瓣门清晰；阴门位于虫体中后部，阴门盖明显；尾部指圆形，无尾尖突。 雄虫热杀死后虫体呈“J”形，体前端与雌虫相似，交合刺大，弓状，成对，基顶高圆，喙突锐尖，交合刺远端具小盘状突(图1B)。 尾端尖细，强烈腹弯，侧面观呈爪状，尾端腹面观可见交合伞，多呈卵圆形，形态多变。

雌虫和雄虫的形态特征完全符合松材线虫的鉴定特征，且唇区、口针及其基部形状、中食道球、雌虫阴门盖、尾部形状、雄虫交合刺、交合伞等典型特征明显(图2)。

图1 辽宁抚顺樟子松中分离的松材线虫成虫热杀死形态Fig.1 Adult of B.xylophilus isolated from P.sylvestris var. mongolica in Fushun，Liaoning province

图2 辽宁抚顺樟子松中分离的松材线虫形态特征Fig.2 Morphological characteristics of B.xylophilus isolated from P.sylvestris var. mongolica in Fushun，Liaoning province

松材线虫形态测量值见表2。 樟子松中松材线虫雌雄成虫体长与红松中的松材线虫体长接近，较落叶松中松材线虫体长[2]普遍略长，尤其是雌成虫更明显。

表2 辽宁抚顺枯死或濒死樟子松上分离的松材线虫形态测计值Tab.2 Morphometric values of B.xylophilus isolated from dead or dying P.sylvestris var.mongolica in Fushun，Liaoning province

2.2.2 ITS 序列分析 对 2 条线虫(Z -1、Z -2)的ITS 基因扩增测序，获得完全一致的2 条ITS 序列，其片段大小为925 bp，在NCBI 上与已知序列比对结果显示，樟子松中分离的线虫与松材线虫B.xylophilus(GenBank 登录号:MN2701176.1)的序列相似性为99.73%。 综上所述，辽宁抚顺樟子松中的寄生线虫鉴定为松材线虫。

图3 基于ITS 基因序列构建的系统进化树Fig.3 Polygenetic tree based on ITS gene sequence

3 结论与讨论

樟子松具有抗旱、耐寒和速生等许多优良特性，在我国“三北”干旱、半干旱风沙地区，被广泛用于营造防风固沙林、农田草场防护林、水土保持林和用材林等，是干旱沙区的优势树种。 本研究首次证实松材线虫在自然条件下能够感染樟子松，且感病较重。 虽然目前仅在辽宁抚顺局部地区发现，但潜在危险性极大。 我国北方防护林多为樟子松纯林，一旦大面积感染松材线虫，将会对我国“三北”防护林体系造成巨大的破坏和冲击。 我国樟子松栽植面积较大的黑龙江、吉林等地区应采取有效的防范措施，科学阻止松材线虫自然传入，严密防范人为传入。凡有樟子松人工林的地区应及时开展专项调查。

初步观察表明，樟子松感染松材线虫后的症状与红松感染松材线虫的症状表现较为接近，感病针叶红褐色，症状发展迅速，一般2 个月左右即可死亡。 详细的发展进程和症状表现有待进一步观察。本次调查取样的30 株感病樟子松中，有22 株病死树分离到松材线虫，检出率高达73.3%，初步分析认为樟子松的感病性较强或抚顺地区樟子松感染松材线虫已有2 ～3 a 历史。 关于樟子松的感病性有待在今后的研究中证实。

从分离的情况看，2019 年春季感染松材线虫且没受到钻蛀性害虫侵害的樟子松，其树体内松材线虫含量较高，密度约1 300 条/g，且种类单纯，无其它线虫。 2019 年以前感染松材线虫且松树死亡1 a以上，同时亦受到钻蛀性害虫侵害的樟子松，其树体内松材线虫的数量急剧下降，且腐生线虫数量较多。对于刚开始感染松材线虫的樟子松，应在感病枝条上取样，其他部位很难分离到松材线虫。 这些初步结果对于全面开展樟子松林松材线虫的调查、监测具有指导意义，对于加强樟子松林的保护和主动预防松材线虫病危害具有警示意义。

志谢：宁波出入境检验检疫局顾建锋博士提供显微摄影设备、图片并提出了重要修改意见，深表感谢!