程 琳张晓艳魏美甜伦尧尧赵 静王晓武李传友

（1 农业农村部设施蔬菜种质创新重点实验室，山东省设施蔬菜分子育种省级重点实验室，山东省蔬菜工程技术研究中心，山东寿光蔬菜种业集团有限公司，山东省寿光蔬菜产业集团有限公司，山东寿光 262700；2 寿光市农业技术中心，山东寿光 262700；3 山东寿光欧亚特菜有限公司，山东寿光 262700；4 山东省生物化学与分子生物学高校重点实验室，潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊 261061；5 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；6 中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京 100101）

由尖孢镰孢菌番茄颈腐根腐病专化型（Fusarium oxysporumf.sp.radicis-lycopersici，FORL）引起的番茄颈腐根腐病（Fusarium crown and root rot，FCRR）（Yamamoto et al.，1974；Jarvis &Shoemaker，1978）是一种重要的土传病害（Benaouali et al.，2014），主要表现为植株茎基部交接处、环绕茎基部有明显的深褐色病斑，被侵染植株苗期易从病斑处折倒而萎蔫致死，5 叶期以后至开花结果期发病则表现为茎基部缢缩、呈深褐色，植株仍然直立而萎蔫致死（耿丽华 等，2012）。

该病害于1974 年首次在日本发现，随后在美洲、欧洲和非洲等多个国家发生，造成严重损失（Sonoda，1976；Jarvis，1988；Rekah et al.，1999；Jacobs &Heerden，2012）。最近几年，我国东北、华北地区发病比较严重，尤以山东省寿光地区病情最为突出。寿光日光温室番茄发病率达80%以上，致死率达30%以上，造成严重减产，已成为山东省继线虫、黄化曲叶病毒病等毁灭性病害暴发之后的另一普遍性番茄病害（程琳 等，2016）。

番茄颈腐根腐病的病原菌侵染周期相对较长，目前还没有安全有效的防范治疗措施（Liu et al.，2010），因此选育抗番茄颈腐根腐病的番茄新品种就成为科学有效的方法。传统育种一般通过人工接种，筛选F.oxysporumf.sp.radicis-lycopersici的抗性材料（Staniaszek et al.，2014）。这个过程耗费时间长、成本高、人工量大。在番茄中，对FORL 的抗性是由1 个显性单基因Frl控制的，而这个基因来源于Solanum peruvianum（Yamakawa &Nagata，1975；Berry &Oakes，1987），并且在已知的3 份抗源材料中抗病基因都是一种（Kamilova et al.，2006）。Frl基因定位在番茄9 号染色体的长臂端，与Tm-2基因紧密连锁（Vakalounakis et al.，1997；Fazio et al.，1999）。Fazio 等（1999）发现了1 个与Frl基因紧密连锁的RAPD 标记，Tanyolac 和Akkale（2010）、Truong 等（2011）也开发得到了一些CAPS 标记，但准确性都无法令人满意。Staniaszek 等（2014）找到了1 个与Frl基因紧密连锁的分子标记C2-25，此标记经过酶切，可有效筛选抗病材料。但是CAPS 标记需要酶切，成本高，试验程序繁琐，检测效率低。

本试验利用C2-25 引物，以25 份背景不同、抗性已知的番茄材料为模板，分别进行PCR，挑取单克隆并测序，得到了抗感病序列。根据抗感病序列的差异位点，分别设计抗病和感病SCAR 标记，利用亲本以及F1筛选得到抗病、感病混合引物对，并用F2群体成功进行了验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2017 年1—6 月在山东省蔬菜工程技术研究中心基地日光温室内进行。使用程琳等（2016）鉴定出的25 份番茄材料进行抗病、感病序列测定。SCAR 标记筛选及验证使用抗病亲本P51、感病亲本P284 及其F1、F2材料。用于测序的25 份材料以及亲本P51、P284，F1材料各种植15 株，F2材料种植700 株。所有材料于2017 年1 月15 日播种，2 月15 日定植，常规田间管理。

病原菌为2014 年9 月在山东省寿光市稻田镇西刘营村农户日光温室内典型番茄颈腐根腐病发病植株上采集，按常规方法保存。

1.2 DNA 提取与PCR 扩增

采集已知表型的25 份材料以及鉴定出表型的亲本F1、F2植株的叶片，采用改良的CTAB 法（Fulton et al.，1995）提取各单株的DNA，利用Staniaszek 等（2014）设计的C2-25 引物序列及新设计的SCAR 引物序列进行PCR。

C2-25 引物胶回收PCR 体系：上下游引物各5 μL，DNA（提取后的DNA 稀释10 倍）20 μL，10× PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 20 μL，dNTPs（2 mmol·L-1）20 μL，MgSO4（25 mmol·L-1）12 μL，KOD-Plus-Neo（1 U·μL-1）4 μL，ddH2O 114 μL。PCR 反应程序：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55℃ 30 s，68 ℃ 45 s，35 个循环；68 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，电压100 V，电泳30 min，紫外灯下切胶和拍照。

C2-25 引物菌落PCR 体系：上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Mix（北京艾德莱生物科技有限公司）10 μL，菌液1 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反应程序同上。

SCAR 标记筛选的PCR 体系：抗病/感病上下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，DNA 2 μL，ddH2O 7 μL。SCAR 标记群体验证的PCR 体系：抗病上下游引物各0.5 μL，感病上下游引物各0.5μL，2×TaqPCR Mix 10 μL，DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。SCAR 标记PCR 反应程序：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃延伸（延伸时间根据延伸速度1～2 kb·min-1计算），35 个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.3 DNA 片段连接转化

1.3.1 PCR 产物回收 使用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒，切胶回收PCR 产物。

1.3.2 产物加A 尾 使用北京艾德莱生物科技有限公司的TaqDNA Polymerase 试剂盒加A 尾。反应体系：回收产物30 μL，TaqDNA Polymerase 1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，dATP（10 mmol·L-1）1 μL，ddH2O 13 μL。轻弹混匀，瞬时离心，在PCR仪上72 ℃延伸30 min。

1.3.3 产物连接转化 使用北京艾德莱生物科技有限公司的零背景pTOPO-TA 克隆试剂盒。连接体系为：pTOPO-T 载 体1 μL（30 ng·μL-1），10×Enhancer 1 μL，PCR 纯化产物8 μL（约50 ng）。加入试剂后吹打混匀，低速瞬时离心，收集离心管底部的所有液体，室温连接5 min。

取50～100 μL 感受态细胞，置于冰上解冻，加入5 μL 连接液，吹打混匀，室温放置5 min。加入300～500 μL 无抗体的LB 培养液，37 ℃、180 r·min-1振荡培养10 min。在含有氨苄青霉素（80 μg·mL-1）的LB培养基上培养过夜。挑取单菌落，摇菌，通过PCR 选择条带大小正确的菌液，每个培养皿选择3 个菌液送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。

1.4 InDel 标记开发、筛选及验证

利用在线比对网站CLUSTALW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw/），比对抗病序列和感病序列，根据二者的差异位点，分别设计了抗病引物和感病引物。无论是正向引物还是反向引物，务必确保引物3′端末位碱基为突变碱基。

将退火温度相近、条带大小合适的引物，分别组合成抗病引物对和感病引物对。以抗病亲本P51、感病亲本P284、F1材料为模板，筛选多态性引物对。将退火温度相近、条带大小合适的抗病引物对和感病引物对混合，以抗病亲本P51、感病亲本P284、F1材料为模板，筛选多态性混合引物组合。

在F2群体中，利用筛选得到的混合引物对进行群体验证，将带型与表型鉴定结果对比，验证标记准确率。

1.5 番茄材料抗病性人工接种鉴定

参照程琳等（2016）的方法，将番茄颈腐根腐病病原菌接种到马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于摇床中以25 ℃、120 r·min-1振荡培养3 d，过滤除去菌体，配制浓度为1×107CFU 的孢子悬浮液。番茄材料在灭菌基质中长至1 片真叶时，用清水将根系清洗干净，放在孢子悬浮液中浸根接种10 min，然后移栽至灭菌基质中，对照用清水浸根10 min，置于18 ℃光照培养箱中培养。接种处理14 d 后，观察、记录番茄材料的发病情况。

2 结果与分析

2.1 测序结果分析

经在线序列比对软件CLUSTALW 比对后，排除随机突变，19 份纯合抗病材料存在1 条完全相同的抗病序列，4 份纯合感病材料存在1 条完全相同的感病序列，2 份杂合抗病材料均存在前述的抗病序列和感病序列。从这25 份材料中得到了2 条序列，根据表型区分出抗病序列和感病序列，共找到了18 个差异位点（图1）。

2.2 SCAR 标记筛选

利用差异位点，设计抗病上游引物8 条，下游引物6 条；感病上游引物7 条，下游引物7 条。选择退火温度相近且目的条带大小在300～1 000 bp的抗病引物和感病引物，分别两两组合。以抗病亲本P51、感病亲本P284、F1材料为模板，筛选得到了5 对在抗病材料中有条带、在感病材料中无条带的抗病标记R-3F/2R、R-4F/6R、R-6F/2R、R-6F/3R、R-6F/4R，6 对在抗病材料中无条带、在感病材料中有条带的感病标记S-3F/2R、S-3F/4R、S-4F/2R、S-4F/6R、S-4F/7R、S-6F/4R（表1）。

在筛选得到的5 对抗病引物和6 对感病引物中，选择退火温度相近、条带差异较大的抗病引物和感病引物，组成20 组混合引物（表2）。以抗病亲本P51、感病亲本P284、F1材料为模板，筛选得到可扩增出370 bp 抗病特异片段和520 bp 感病特异片段的连锁SCAR 标记R-6F/2R、S-3F/4R（图2）。

表1 C2-25 及筛选得到的SCAR 引物序列

表2 混合引物组合

2.3 混合标记在F2群体中单株验证

以混合引物组合在500 株F2群体中筛选，122株材料扩增出370 bp 的条带，为纯合抗病；257 株材料同时扩增出了370 bp 和520 bp 的条带，为杂合抗病；121 株材料扩增出了520 bp 的条带，为纯合感病（表3）。

采用人工接种鉴定病原菌的方法对亲本、F1、F2材料进行抗病性鉴定。结果表明，F2群体中373株材料表现抗病，127 株材料表现感病。抗病材料外观无显著变化，感病材料茎基部缢缩，出现褐色病斑，幼苗从病斑处倒折（图3）。在500 株F2材料中，473 株材料人工接种鉴定结果与分子标记检测结果一致，准确率达到94.6%。

表3 部分F2个体的分子鉴定结果及人工接种抗病性鉴定结果

3 讨论与结论

现有的颈腐根腐病分子标记多为RAPD、CAPS 标记，但有的准确性比较低，有的操作比较繁琐，需要寻找结果更加准确，操作更加简便，可用于高通量筛选的分子标记。本试验利用准确性较高的CAPS 标记C2-25，以25 份不同背景、已知抗性的番茄材料为模板，得到了抗病序列和感病序列，根据序列差异分别设计了抗病引物和感病引物。利用抗病亲本、感病亲本、杂合F1，先筛选得到了多态性抗病引物和感病引物，之后再将抗病引物和感病引物混合，筛选得到了多态性的抗病、感病混合引物组合，可扩增出370 bp 抗病特异片段和520 bp 感病特异片段。

在500 株F2材料中，473 株材料人工接种鉴定结果与分子标记检测结果一致，准确率达到了94.6%。仍有27 株材料检测结果不一致，这种差异可能与这个分子标记和抗病基因Frl间尚存在一定的连锁距离有关，因此后续研究可开发与抗病基因Frl连锁关系更近乃至基因内部标记，从而提高分子标记鉴定的准确度。同时，为了提高通量，配合LGC 技术，也应该开发SNP 分子标记。