常江，张玲，代正云，夏效东，杨华，唐标*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 2.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；3.湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南 永州 425100)

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)是一种重要的人畜共患病原菌，能够引起绵羊流产、小牛发热和腹泻、牛乳房炎、禽类肝炎等症状[1]，同时也可引起人的急性肠炎和格林-巴利综合征等疾病[2]。空肠弯曲杆菌的传播流行不仅严重影响畜禽养殖业发展，也对人类健康造成极大危害。空肠弯曲杆菌在自然界中分布广泛，家禽(尤其是鸡)是其主要的贮存库和传染源，在空肠弯曲杆菌的传播扩散中发挥重要作用[3]。根据欧洲食品安全局(EFSA)的相关报道，50%～80%的弯曲杆菌感染源于鸡和鸡肉产品，与此同时，空肠弯曲杆菌是造成人类弯曲杆菌感染的主要原因，占所有感染病例的80%～90%[4-5]。近年来，畜禽养殖环节中抗生素的大量使用，引发了严重的空肠弯曲杆菌耐药性，极大地增加了空肠弯曲杆菌疾病预防和控制的难度，对公共卫生安全构成了严峻挑战[6]。因此，补充完善鸡场空肠弯曲杆菌的流行病学资料和耐药数据库，有助于空肠弯曲杆菌疾病的防治和养殖场抗生素的科学使用，对提高养殖效益和维护公共卫生安全具有重要意义。

随着宁德地区鸡养殖产业的发展，空肠弯曲杆菌传播感染趋于增多，对养鸡业发展造成严重影响，也构成了一定的公共卫生安全隐患。本研究对宁德地区鸡场空肠弯曲杆菌的流行状况进行调查，利用MLST技术分析空肠弯曲杆菌的种群特征，同时对分离得到的空肠弯曲杆菌进行耐药性检测，为预防和控制鸡场空肠弯曲杆菌，特别是多重耐药空肠弯曲杆菌的传播流行提供数据依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2018年9月，在福建省宁德地区的部分鸡场随机采集100份新鲜粪便样品。样品采集用试剂、器具、耗材等均经过高温高压灭菌，或为一次性无菌材料。使用无菌棉签挑取适量鸡粪便样品于弯曲杆菌采集液中，放置于装有微需氧袋的密封盒，保存于低温采样箱中，随后运送至实验室进行空肠弯曲杆菌分离鉴定。

1.2 主要试剂

Bolton肉汤及添加剂、布氏肉汤、改良CCD琼脂基础(mCCDA)购自北京陆桥技术股份有限公司；弯曲杆菌增菌液、哥伦比亚血平板、微需氧产气袋购自山东青岛中创生物有限公司；无菌脱纤维绵马血购自南京便诊生物科技有限公司；甘油购自上海生工生物工程股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；2×TaqMaster Mix、GenGreen核酸染料、DL5000 Marker购自上海赛默飞世尔科技有限公司；弯曲杆菌药敏检测板购自天津金章科技发展有限公司；空肠弯曲杆菌ATCC33560作为药敏实验质控菌株，购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)。

1.3 方法

1.3.1 空肠弯曲杆菌分离培养

吸取1 mL空肠弯曲杆菌采集液加入Bolton肉汤中，微需氧条件(5% O2、15% CO2、85% N2)下42 ℃培养48 h后，将培养后的Bolton肉汤轻微摇匀后，吸取20～30 μL于mCCDA平板上，使用10 μL接种环分四区划线，随后在微需氧条件下42 ℃培养24～48 h。使用1 μL接种环挑取3～5个mCCDA平板上的浅灰色、扁平、湿润的可疑菌落划线于哥伦比亚血平板上，微需氧条件下42 ℃培养24 h后，使用1 μL接种环挑取扁平、湿润、白色的疑似单菌落划线于哥伦比亚血平板上进行进一步纯化，微需氧条件下培养24 h后，使用10 μL接种环或无菌棉签刮取菌落，随后转移至含20%甘油的布氏肉汤(含5%反复冻融的无菌脱纤维马血)的冻存管中，-80 ℃条件下保藏。

1.3.2 空肠弯曲杆菌多重PCR鉴定

将疑似空肠弯曲杆菌划线接种于哥伦比亚血平板上，42 ℃微需氧条件下培养24 h，从哥伦比亚血平板上刮取少许菌落于150 μL的TE缓冲液(pH 8.0)中，涡旋混匀，参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取，将提取完成的DNA于-20 ℃保存备用。

参考相关文献[7-8]，由杭州擎科新业生物技术有限公司合成针对弯曲杆菌属16S rRNA及空肠弯曲杆菌mapA基因的特异性鉴定引物(表1)。PCR反应体系为50 μL：2×EasyTaqPCR Mix 25 μL、上下游引物各为1.5 μL、DNA模板为0.5 μL、无菌水为21.5 μL。PCR反应条件为：96 ℃ 5 min；96 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。电泳条件：吸取PCR产物3 μL上样，使用1.2%琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，120 V电压下电泳35～40 min。电泳结束后使用凝胶成像仪进行凝胶成像，根据条带有无及大小判断鉴定结果。

表1 PCR引物的序列和长度

1.3.3 空肠弯曲杆菌MLST分型

参考Dingle等[9]的报道，使用空肠弯曲杆菌基因组上的7个管家基因(aspA、glnA、gltA、glyA、tkt、pgm、uncA)作为目的基因，进行PCR扩增，扩增产物寄至上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。随后将测序得到的DNA序列在线提交至MLST 2.0(https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/)[10]进行序列比对分析，获得空肠弯曲杆菌的等位基因型及序列型。

1.3.4 空肠弯曲杆菌药敏试验

参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，使用天津金章科技发展有限公司的弯曲杆菌药敏检测板测定空肠弯曲杆菌分离株对庆大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、红霉素(ERY)、阿奇霉素(AZI)、四环素(TET)、氟苯尼考(FLO)、克林霉素(CLI)、泰利霉素(TEL)等9种常见抗生素的药敏特性，质控菌株为空肠弯曲杆菌ATCC33560，药敏结果判读参考CLSI制定的相关药敏标准。

2 结果与分析

2.1 空肠弯曲杆菌的分离鉴定

从采集的100份样品中，分离得到疑似空肠弯曲杆菌23株，分离率为23%。空肠弯曲杆菌多重PCR鉴定结果显示，所有疑似空肠弯曲杆菌均可扩增出2个条带，条带明亮，大小相符，呈现阳性(图1)。

M—5 000 bp DN A marker；1—空肠弯曲杆菌ATCC33560；2～13—分离菌株；14—阴性对照。图1 空肠弯曲杆菌多重PCR电泳图

2.2 空肠弯曲杆菌MLST分型结果

23株空肠弯曲杆菌共分为了14个序列型。如表2所示，优势序列型为ST354(17.4%)，其次为ST464(13.0%)，空肠弯曲杆菌在宁德地区鸡场中具有丰富的遗传多样性。

表2 23株空肠弯曲杆菌的序列型分布及等位基因谱

2.3 空肠弯曲杆菌药敏特性

对23株空肠弯曲杆菌进行9种常见抗生素的耐药性检测，药敏检测结果见图2。23株空肠弯曲杆菌对萘啶酸(91.3%)、四环素(91.3%)和环丙沙星(87.0%)的耐药率最高，其次为庆大霉素(8.7%)、氟苯尼考(8.7%)、红霉素(4.4%)，对泰利霉素、阿奇霉素和克林霉素表现为敏感。

图2 23株空肠弯曲杆菌对不同抗生素的耐药率

如表3所示，在23株空肠弯曲杆菌分离株中，所有菌株均表现出至少1种耐药表型，耐药菌株占比为100%；5株分离株对1～2种抗生素耐药；其他18株则表现出多重耐药现象(至少耐3种及3种以上抗生素)，多重耐药率为78.3%。菌株耐药模式多样，主要的耐药表型为NAL+CIP+TET，占比为60.9%。

表3 23株空肠弯曲杆菌的耐药谱

注：GEN—庆大霉素；NAL—萘啶酸；CIP—环丙沙星；ERY—红霉素；AZI—阿奇霉素；TET—四环素；FLO—氟苯尼考；CLI—克林霉素；TEL—泰利霉素。

3 讨论

MLST分型是一种重要的流行病学调查研究手段，相较于传统的生化手段，能够更快速地分析种群的结构及生物进化关系[11]。姚学萍等[12]对四川部分地区分离的48株禽源空肠弯曲杆菌进行MLST分型，结果显示，48株空肠弯曲杆菌共获得24种不同的序列型；董俊等[13]对47株禽源空肠弯曲杆菌湖北分离株进行分子分型研究，结果显示，分离株共包含38个ST型存在；本研究分离自养鸡场粪便样品的23株空肠弯曲杆菌中，共检测到14种序列型存在，以上结果表明禽源空肠弯曲杆菌具有较高的遗传多样性。沙门菌等其他菌常具有明显的优势ST型[14]。本研究及其他相关报道中，各ST型的空肠弯曲杆菌数量相对接近，没有明显的优势ST型，反映出禽源空肠弯曲杆菌流行传播的复杂性，也进一步显示空肠弯曲杆菌预防和控制的难度。

本研究检测到的14种序列型中，包含7种新序列型，新序列型菌株占比为43.5%。新序列型菌株的数量较大可能是由于MLST数据库中空肠弯曲杆菌的数据量仍较少。此前MLST数据库中的空肠弯曲杆菌样本来源主要是欧美及大洋洲国家，亚洲地区国家的数据量相对较少[13]。本研究的相关结果进一步丰富了MLST数据库，也为研究不同区域的空肠弯曲杆菌流行病学提供了数据基础。

近年来，抗生素的大量使用导致弯曲杆菌耐药性显著增强，对公共卫生安全构成重大威胁[15-16]。2017年，世界卫生组织将氟喹诺酮耐药空肠弯曲杆菌列为优先2级(高度耐药)[17]，显示出该型耐药细菌流行传播的高风险性。本研究中，23株空肠弯曲杆菌对萘啶酸、四环素和环丙沙星的耐药率分别高达91.3%、91.3%及87.0%，表现出对四环素和喹诺酮类(萘啶酸、环丙沙星)抗生素的高度耐药。高风险耐药空肠弯曲杆菌在鸡场的流行传播不仅会影响鸡养殖产业的健康发展，也在一定程度上对人类健康构成潜在威胁。

本研究中，所有受试空肠弯曲杆菌菌株均表现出至少1种耐药表型，同时78.3%的菌株表现多重耐药，且耐药谱呈现多样化，反映了鸡场空肠弯曲杆菌严重的耐药状况。细菌染色体基因组及质粒携带的获得性耐药基因是引起细菌产生耐药性的主要原因[18]。宁德地区鸡场空肠弯曲杆菌严重且复杂的耐药特征表明，鸡场来源空肠弯曲杆菌可能携带多个耐药基因，空肠弯曲杆菌携带的耐药基因通过水平传播及垂直传播等方式发生广泛的传播扩散，将使得细菌耐药性问题得到持续的发展，危害公共卫生健康[19]。为更加有效地了解和控制养鸡场来源空肠弯曲杆菌耐药性的产生及传播，未来将使用PCR技术及全基因组测序技术对空肠弯曲杆菌携带耐药基因的传播转移机制进行进一步的探究。

本研究以福建省宁德地区鸡场来源空肠弯曲杆菌为研究对象，对其ST型分布和药敏特性进行了探究，揭示了宁德地区养鸡场中空肠弯曲杆菌的流行状况和耐药特征，为防控空肠弯曲杆菌特别是多重耐药空肠弯曲杆菌的传播流行提供依据。研究结果显示，宁德地区鸡场来源空肠弯曲杆菌的遗传多样性较高，且对四环素及喹诺酮类抗生素具有较高的耐药水平，对鸡养殖产业和人类健康造成潜在威胁。宁德地区乃至更广泛的地区应继续加强动物源细菌耐药性监测，并在养殖环节规范、减量化使用抗生素，防范公共安全风险。