刘永安，黄业昌，潘彬荣，岳高红，梅喜雪，许立奎*，张宗宸

(1.浙南作物育种重点实验室，浙江 温州 325006； 2.温州市农业科学研究院，浙江 温州 325006)

高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦籽粒中的贮藏蛋白，尽管其含量只占小麦籽粒蛋白质总含量的12%左右，但其对各种面食加工品质的影响却很大。其中，HMW-GS对面包加工品质的影响最大，其贡献率达70%左右[1-2]。

在普通六倍体小麦中，HMW-GS由分别位于1 A、1B和1D染色体长臂上的Glu-1A、Glu-1B和Glu-1D位点编码，每一位点由编码分子量较大的x亚基基因和分子量较小的y亚基基因构成[3-4]。由于个别HMW-GSs基因的沉默，在普通小麦中通常只有3～5个HMW-GSs基因表达，而不是理论上的6个[5-6]。HMW-GSs具有丰富的多态性。

SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)电泳是一种常用的检测小麦不同品种HMW-GSs组成的方法，其原理简单，易于初学者掌握。然而，这种方法容易将迁移率相近的不同HMW-GSs做出误判，尤其是上样量大的情况下，电泳条带变宽，亚基之间的差异就更会被掩盖，往往被误认为是同一个蛋白亚基[7]。为了克服这一问题，本研究在传统SDS-PAGE电泳系统的基础上加入了放大胶，即该改良SDS-PAGE电泳系统包括浓缩胶、放大胶和分离胶，从而使电泳的分辨率得到明显提升。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的材料为小麦品种中国春和宁春4号。其中，中国春的高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成为N、1Bx7+1By8、1Dx2+1Dy12，宁春4号的HMW-GS组成为1Ax1、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy10[7-8]。

1.2 方法

1.2.1 HMW-GS的提取

用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入一个预先准确称量质量(精度为0.001 g)的1.5 mL离心管中，再称量其质量以计算样品的质量；然后往离心管中放入1粒直径为4.0 mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1 500 r·min-1研磨3 min；按每mg加25 μL蛋白质提取液，含70 mmol·L-1Tris-HCl，2% (V/V)β-巯基乙醇，2% (m/V) SDS，20% (V/V)甘油， 0.005% (m/V) 溴酚兰，于涡旋混匀器上充分混匀；沸水浴10 min，取出冷却至室温，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液上样。

1.2.2 传统SDS-PAGE电泳

本研究SDS-PAGE采用双板夹芯式垂直电泳槽(北京六一 DYCZ-30C)和DYY-8C型电泳仪。浓缩胶的浓度为5%，分离胶的浓度为12.5%，两者交联度均为3.33%，当溴酚蓝跑出凝胶后即停止电泳，考马斯亮蓝染色。

1.2.3 改良SDS-PAGE电泳

传统SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝染色，查看中国春和宁春4号HMW-GS分离情况，然后用直尺测量宁春4号1Ax1亚基在分离胶内的迁移距离，并据此计算放大胶的灌入量。改良SDS-PAGE电泳系统的浓缩胶浓度为5%，放大胶的浓度为12.5%，分离胶浓度为8%，三者交联度均为3.33%，电泳时间跟传统SDS-PAGE凝胶电泳相同，考马斯亮蓝染色。

2 结果与分析

2.1 传统SDS-PAGE电泳结果

从图1中A可以看出，中国春的1Dy12亚基和宁春4号的1Dy10亚基的迁移速率非常接近，尤其是泳道1中的1Dy12亚基与泳道2中的1Dy10亚基的迁移速率几乎不能看出差异，这样就很容易将两者误认为同一亚基。

1—中国春；2—宁春4号；3—中国春；4—宁春4号。图1 传统SDS-PAGE电泳(A)和改良SDS-PAGE电泳(B)结果

2.2 改良SDS-PAGE电泳结果

从图1中B可以看出，中国春及宁春4号不同高分子量谷蛋白亚基间的距离被明显拉大，不同泳道间亚基迁移速率的差异也被放大，能够较轻松地将泳道1和泳道3中的1Dy12亚基与泳道2和泳道4中的1Dy10亚基区分开来。

3 小结与讨论

传统SDS-PAGE电泳一般采用的是不连续缓冲系统，该体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成。其中，浓缩胶的作用主要是堆积作用，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易地通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快，大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。

在改良SDS-PAGE电泳系统中，浓缩胶的浓度较小，孔径较大，其作用跟传统的不连续缓冲系统的作用一样，主要是堆积作用。放大胶的浓度较

大，孔径较小，对蛋白质样品起到初步分离的效果。分离胶的浓度较放大胶低，孔径较放大胶大，因而蛋白质分子在其中的迁移速度较放大胶快，当分子量较小的蛋白质分子从放大胶迁移到分离胶后，其迁移速率将加快，而分子量较大的蛋白质分子仍然以较慢的速度在放大胶中迁移，这样不同分子量的HMW-GSs从放大胶迁移到分离胶后，它们之间的距离将被拉大，即起到放大的作用。

与传统SDS-PAGE电泳系统相比，改良SDS-PAGE电泳系统增加了放大胶，灌胶过程相对复杂。不过，改良SDS-PAGE电泳通过放大胶的放大作用，可将不同HMW-GSs条带间的距离明显拉大，其分辨率得到显著提高。目前，放大胶在SDS-PAGE电泳检测小麦HMW-GSs方面还处于探索阶段，如能对其进行完善，相信该技术将成为传统SDS-PAGE电泳的一个重要补充。