徐雨霁 朱炳伟 刘永林

肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia）又称原发性非典型肺炎，为非典型肺炎中的一种，是由肺炎支原体（MP）感染引起，约占儿童社区获得性肺炎（CAP）的10%～40%［1］。实时荧光定量PCR法（Quantitative real-time PCR）为目前临床普遍采用的分子生物学诊断技术，只需要少量的DNA片段就可以检测出，该方法检测时间短，所需样本量少，具有较好的灵敏度和特异性，但是还是容易出现假阳性。近年来一些新的诊断技术不断涌现，实时荧光恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，SAT）作为新型的分子诊断技术，直接检测存在于活菌体内的特异性RNA片段，相比于DNA检测，具有较高的灵敏度和特异性［2］。本文对210例在本院住院治疗的小儿肺炎患者咽拭子标本分别进行MP-SAT和MP-DNA检测，并将两者检测结果进行分析比较。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年4月至2018年4月本院儿科收治的210例肺炎患儿，其中男113例，女97例；入院年龄1个月至14岁，平均年龄4岁。具体年龄分布：0～3岁90例，4～9岁105例，10～14岁15例。所有入院患儿经临床检查，均有发热、咳嗽等呼吸道感染症状，并排除了其他病因。小儿肺炎诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》中的相关诊断标准［3-4］。所有患者均在入院当天采集咽拭子标本后立即送检验科检测。

1.2 仪器与试剂 PCR仪器型号为瑞士罗氏公司生产的Cobas Z480型全自动荧光定量PCR仪。DNA检测试剂为中山大学达安基因股份有限公司生产的MP核酸检测试剂盒。RNA检测试剂为上海仁度生物科技有限公司生产的MP核酸检测试剂盒。

1.3 方法 （1）MP-DNA检测方法：加灭菌生理盐水1.5ml至咽拭子采样管中，充分震荡摇匀，吸取1ml液体至EP管中，12000rpm离心5min后去上清液，沉淀中加入50μl DNA提取液，充分震荡混匀，100℃金属浴10min，12000rpm再离心5min，取上清液2μl用于DNA扩增。（2）MP-SAT检测方法：在EP管中分别加入100μl核酸提取液，10μl MP内标溶液和400μl样本。将上述EP管放进恒温金属浴进行60℃温浴，保持5min后取出，再室温放置10min。将EP管置于磁珠分离器上，静置5min，待磁珠吸附于管壁后，用电动吸引器吸走管中的液体，保留磁珠，并加入1ml洗涤液洗涤2遍。将EP管移离磁珠分离装置，每管分别加入40μl扩增检测液，取30μl 扩增检测液（包含磁珠）至微量反应管内用于RNA扩增。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同性别和年龄组MP-SAT阳性率比较 210例肺炎患儿MP-SAT检测发现61例阳性，总阳性率为29.0%。其中，男性患儿113例，阳性36例，阳性率为31.9%；女性患儿97例，阳性25例，阳性率为25.8%。男女患儿之间阳性率的比较，差异无统计学意义（χ2=0.94，P＞0.05）。其中0～3岁组检测出15例阳性，阳性率为16.7%；4～9岁组检测出41例阳性，阳性率最高为39.0%；10～14岁组检测出5例阳性，阳性率为33.3%。其中0～3岁组与4～9岁组比较，两组之间差异有统计学意义（χ2=11.86，P＜0.05），其余两组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 两种检测方法检测结果的比较 210份咽拭子标本分别采用MP-SAT与MP-DNA检测，其中MP-SAT检测出61例阳性，阳性率为29.0%；MP-DNA检测出58例阳性，阳性率为27.6%，两种方法间差异无统计学意义（χ2=0.11，P＞0.05）。两种方法检测结果相一致的患者193例，两者之间符合率为91.9%；两种方法检测结果不一致的患者17例，不符合率为8.1%，其中10例样本MP-SAT检测阳性而MP-DNA阴性，7例样本MP-SAT检测阴性而MP-DNA阳性。以MPDNA法的检出阳性率和阴性率作为对照，根据公式计算MP-SAT的相对灵敏度和特异度，结果显示MPSAT法的灵敏度为87.9%，特异度为93.4%，见表1。

表1 MP-SAT和MP-DNA之间检测结果的比较（n）

3 讨论

本资料中MP是儿科住院患儿感染的重要病原体，男女感染机会均等，与国内其它相关报道一致［5-6］。本资料表明，不同年龄组之间MP感染阳性率差别较大，4～9岁组的阳性率最高，这可能是由于幼儿园学龄前儿童的免疫力比较弱和集体活动较多，与国内相关文献报道基本一致［7］。其次是 10～14岁组，阳性率相比4～9岁组略有下降，可能是由于该年龄组儿童逐渐进入青春期，身体免疫功能增强。0～3岁组的阳性率最低，这可能是由于该年龄组儿童活动范围相对较小，集体活动少有关。

本资料通过对本院210例肺炎患儿咽拭子标本分别进行MP-SAT和MP-DNA检测发现，两种方法的阳性率较为接近，且检测结果具有较好的一致性和符合率（91.9%），以MP-DNA方法作为参照，与该检测方法对比显示MP-SAT检测MP的相对敏感度和特异度分别为87.9%和93.4%，提示该方法具有良好的诊断价值，且特异度较高。两种方法检测结果有17例结果不一致，其中10例样本MP-SAT检测阳性而MPDNA阴性，这可能是由于：（1）标本被污染，有的污染物对DNA的扩增有抑制作用，从而造成了假阴性。（2）SAT技术的检测灵敏度更高，在本资料中，MPDNA试剂提取采用传统的煮沸裂解法，而MP-SAT技术的提取采用了最新的磁珠法，有相关研究报道证实，磁珠法的提取效率是煮沸裂解法的10倍，尤其在低拷贝数样本中，明显优于煮沸法［7］。本资料中另外有7例样本MP-SAT检测阴性而MP-DNA阳性，收集临床数据进一步研究发现其中4例患儿入院前已经接受过抗生素治疗，推测可能原因为MP已经被杀灭而RNA已被降解，从而造成了MP-SAT检测结果的阴性。而另外3例样本可能是由于操作人员的不规范操作引起的实验室交叉污染，从而造成的假阳性结果。

综上所述，MP-SAT技术对于儿童肺炎支原体肺炎的早期诊断具有一定价值，并具有更好的诊断敏感性和特异性，可以作为一种新的方法用于肺炎支原体的早期检测。