舒春晖 王丽倩 温小姿 安瑞 沈浩 王贤军

艰难梭菌（Clostridium difficile）是革兰阳性、专性厌氧的芽孢杆菌，为人体肠道中的正常菌群，也是导致抗生素相关性腹泻的主要原因。临床大量使用抗菌药物、免疫抑制剂、质子泵抑制剂或化疗药物等导致肠道微生态失衡，引发艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI），其主要致病机制与该菌产毒素A（tcdA）和毒素B（tcdB）有关［1］，毒素A是一种肠毒素，毒素B为细胞毒素，其分别由tcdA和tcdB基因编码。据美国2014 年一项研究报道，2010年住院患者CDI的发病率比2001年几乎增加了1倍［2］。随着全球CDI的爆发和流行，国内感染CDI病例的报道日渐增多，MLST分型逐渐被公认为操作简便、重复性好的分子技术。该方法通过PCR 扩增多个管家基因内部片段并测定其序列，确定细菌ST型别。2017年美国感染协会制定了关于成人和儿童艰难梭菌感染最新诊疗指南［3］，针对CDI症状的定义，腹泻患者检测到产毒型艰难梭菌或伪膜性结肠炎的症状，根据患者的白细胞数、血肌酐水平以及临床症状等将CDI严重程度分为轻度、中度、重度和极重度的分级体系［3］。但由于我国艰难梭菌研究起步较晚，有关 CDI的系统研究报道较少，更无关于艰难梭菌毒素基因、MLST分型和CDI严重程度相关性的研究，作者课题组前期研究发现［4］，艰难梭菌毒素蛋白阳性患者常伴有严重的艰难梭菌感染，基于以上基础，本实验回顾性分析艰难梭菌分子分型与艰难梭菌感染分级的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2016年3月1日至2017年5月30日杭州市第一人民医院腹泻患者粪便样本860例，同时收集患者的基本临床资料，包括患者的姓名、性别、年龄、就诊科室和临床诊断等。患者钠入标准：腹泻时间＞48h；腹泻＞3次/d。采集不成形粪便标本（≥5ml）送检，每份样本分装2管，-80℃冻存备用于CD培养和毒素基因检测，已通过医院伦理委员会的免签知情同意书。

1.2 仪器与试剂 （1）实验仪器：MALDI-TOF质谱仪（德国Bruker-Daltonics公司）；厌氧培养系统（荷兰Anoxomat MARK公司）；CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司）；Veriti 96PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；裂解仪（中国博日科技有限公司）；漩涡混匀器（美国Binder公司）；高速冷冻离心机（美国Eppendorf公司）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）等。（2）实验试剂：PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、Mgcl2（美国Pfizer公司）；QIAGE QIAamp DNA Stool Mini Kit（德国QIAGE公司）；艰难梭菌选择性培养基（法国Merieux公司）。

1.3 方法 （1）艰难梭菌厌氧培养及鉴定：对860份腹泻样本经室温解冻，经75%酒精处理后涂布于CCFA培养基，37℃厌氧培养48h，挑取灰黑扁片的可疑菌落采用质谱鉴定。（2）基因组DNA提取及分子检测：艰难梭菌基因组DNA提取按照QIAGE试剂盒说明书进行。通过PCR技术扩增毒素基因A和B，其引物序列参考 Lemee［5］和 Kato［6］团队的研究方案，tcdA的PCR反应条件如下：94℃预变性15min，35个循环94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸40s，最后延伸72℃5min。tcdB的PCR反应条件如下：94℃预变性15min，35个循环94℃变性20s，62℃退火120s，74℃延伸40s，最后延伸72℃5min。多位点序列分型（MLST）引物参照Griffth等［7］文献，反应体系包括PCR总反应体系50μl：灭菌双蒸水22μl，TAKARA Taq Premix酶 25μl，上下游引物各1μl，模板DNA1μl。选取7个管家基因（adk，atpA，dxr，glyA，recA，sodA和tpi）进行 PCR 扩增并测序，将序列与数据库比对，分析菌株的ST型别。（3）艰难梭菌感染严重分级：参照2017版美国感染病协会（IDSA）制定的艰难梭菌感染的诊疗指南［3］，将艰难梭菌感染严重程度分为3级。轻度（1级）：血白细胞升高但＜15000/mm3，且血肌酐＜1.5mg/dl；中度（2级）：血白细胞＞15000/mm3，或血肌酐＞1.5mg/dl；重度和极重度（3级）：出现由艰难梭菌感染引起的低血压、休克、肠梗阻、巨结肠等严重疾病。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验和Fisher确切概率法的数据分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料 根据患者的临床资料和检测结果，860例腹泻粪便中共检出艰难梭菌98例，产毒型艰难梭菌94株，tcdA-tcdB+菌株52株（55.3%，52/94），tcdA+tcdB+菌株42株（44.7%，42/94）。其中男52例，女42例。社区CDI构成比占45.7%，院内CDI构成比占54.3%。

2.2 不同艰难梭菌毒素基因表型和CDI患者临床指标结果分析 统计分析毒素基因tcdA-tcdB+与tcdA+tcdB+在腹泻次数、血白细胞计数、肌酐水平及白蛋白数值的差异，血白细胞计数和肌酐水平的差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同艰难梭菌毒素基因表型的CDI患者临床指标结果分析（±s）

表1 不同艰难梭菌毒素基因表型的CDI患者临床指标结果分析（±s）

项目 tcdA-tcdB+（n=52） tcdA+tcdB+（n=42） t值 P值腹泻次数（次/d） 3.9423±1.56448 3.5476±1.25333 -1.049 0.294白细胞计数（×109/L） 11.4327±5.38767 8.5721±3.01014 -2.434 0.015白蛋白（g/L） 35.3923±9.07174 37.2643±8.40267 -0.776 0.438肌酐（μmol/L） 90.6731±92.54818 59.3817±21.13482 -2.211 0.027

2.3 艰难梭菌毒素基因表型与CDI类别的相关性分析 艰难梭菌毒素基因tcdA-tcdB+患者在院内CDI占61.5%，毒素基因tcdA-tcdB+和tcdA+tcdB+在院内和社区CDI的构成比无明显差异（P=0.115）。艰难梭菌毒素基因tcdA-tcdB+患者中21.2%为CDI Ⅲ级，毒素基因tcdA-tcdB+和tcdA+tcdB+的CDI各级构成比有差异（P=0.007），表明tcdA-tcdB+相比tcdA+tcdB+更易引起严重的艰难梭菌感染。见表2。

表2 艰难梭菌毒素基因表型与CDI类别的相关性分析［n（%）］

2.4 艰难梭菌MLST分型中ST37型与非ST37型患者各临床检测结果分析 94株艰难梭菌共分离出15种ST型，其中数量最多的分别为ST37型25株（26.6%，25/94），ST54型20株（21.3%，20/94）和ST81型15株（16.0%，15/94）。分析ST37型与非ST37型在腹泻次数、血白细胞计数、肌酐水平及白蛋白数值的差异，发现腹泻次数和血白细胞计数差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 3。

表3 艰难梭菌ST37型和非ST37型中CDI患者临床指标结果（±s）

表3 艰难梭菌ST37型和非ST37型中CDI患者临床指标结果（±s）

类别 ST37（n=25） 非ST37（n=69） t值 P值腹泻次数（次/d） 5.357±1.906 5.025±6.647 -2.862 0.004白细胞计数（×109/L） 12.316±5.309 9.395±4.239 -2.453 0.014白蛋白（g/L） 37.212±8.431 35.827±8.998 -0.702 0.483肌酐（μmol/L） 91.840±97.266 71.588±60.139 -1.023 0.306

2.5 艰难梭菌ST37型和非ST37型与CDI类别的相关性分析 艰难梭菌ST37型与非ST37型在院内和社区CDI的构成比无明显差异（P=0.792）。但艰难梭菌ST37型和非ST37型患者CDI各级构成比有显著差异（P=0.011），其中ST37型患者中28.0%为CDI Ⅲ级，表明艰难梭菌ST37更易引起严重的CDI，见表5。

表5 艰难梭菌ST37型和非ST37型与CDI类别的相关性分析

3 讨论

2000年以来，艰难梭菌相关性感染的发病率不断上升，尤其是高毒力菌株RT027/NAP1/BI在欧美地区暴发流行，病死率也迅速增加，已成为影响全球公共卫生的健康问题［8］。我国 CD感染率也正在不断上升，Chen等［9］研究了浙江省三甲医院的1845位腹泻患者，并分离到艰难梭菌产毒菌株161株，分离率8.73%，本次研究中产毒素株分离率高达10.9%（94/860），足见我省艰难梭菌感染的严重性。毒素是艰难梭菌感染主要的致病因素，毒素A是肠毒素，主要引起肠道炎症，导致肠壁出血坏死；毒素B是细胞毒素，可刺激单核细胞释放炎性细胞因子，直接损伤肠壁细胞，严重的甚至造成伪膜性肠炎［10］。欧美国家流行的艰难梭菌主要以tcdA+tcdB+菌株为主，而亚洲国家tcdA-tcdB+菌株主要以ST37为主［11］，本研究显示，tcdA-tcdB+和tcdA+tcdB+基因表型为主要流行特征，其中tcdA-tcdB+ 基因型的大部分菌株是ST37型，这和Dazhi Jin等［12］关于艰难梭菌在中国东部的分子流行病学研究的报道一致。

本研究发现tcdA-tcdB+菌株比tcdA+tcdB+菌株更能引起CD感染患者白细胞计数和肌酐水平升高，并且CDI Ⅲ级中全为tcdA-tcdB+基因型，提示tcdA-tcdB+可能更易引起严重CDI。有报道显示，只产毒素B的菌株（tcdA-tcdB+）容易引起暴发流行和伪膜性结肠炎［13］。也有 Pengcheng Du等［14］提出，tcdA-tcdB+毒素表型的艰难梭菌容易引起医院感染爆发，并在全球范围内被频繁检出，tcdA-tcdB+患者常伴有严重的临床症状和较高复发率，但其发病机制尚待进一步研究。

ST37型是目前中国常见的流行特征［15］，本研究发现CDI Ⅲ级的11例患者中7例为ST37型。由Tian等提出［16］，ST37型有更强的致病能力和耐药性。国内少有文献关于ST37型与临床检验结果相关性的报道，本研究发现ST37型比非ST37型腹泻次数更多、白细胞计数更高，且差异有统计学意义，这可能是因为ST37型的tcdA和tcdB基因与高毒力菌株具有相似性，表现出更强的毒性［17］，导致患者临床症状更明显，病情更严重。但ST37型的致病机制仍不清楚。

综上所述，毒素基因tcdA-tcdB+比tcdA-tcdB+患者白细胞计数和肌酐水平更高，常伴有严重的腹泻等症状。ST37型患者腹泻次数更多、白细胞计数更高，更容易导致艰难梭菌感染。因此，对艰难梭菌感染患者应及时进行菌株毒素基因检测和MLST分型，可为临床更精准的诊疗提供帮助。