于文萃，高毓涛

(1.辽宁地质工程职业学院，辽宁 丹东 118000；2.丹东市市场监管事务服务中心，辽宁 丹东 118002)

牛黄清胃丸具有清胃泻火，润燥通便的功效.临床用于心胃火盛，头晕目眩，口舌生疮，牙龈肿痛，乳蛾咽痛，便秘尿赤等症候.其制剂标准收载于《卫生部药品标准》第一册(中药成方制剂)，处方由人工牛黄、大黄、菊花、麦冬、薄荷、石膏、栀子、玄参、番泻叶、黄芩、甘草、桔梗、黄柏、连翘、牵牛子(炒)、枳实(沙烫)、冰片等17味中药组成.现代研究[1-2]表明，方中的大黄、番泻叶主要有效成分为蒽醌及其衍生物，具有破气除胀，清热泻火，倒滞通便的功效.其中含有已知的主要蒽醌类活性成分为大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等，具有抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管、调节肝肾功能等多种临床功效[3-6].由于该产品制剂的质量标准中并未对其有效成份进行监测，为了更好的控制牛黄清胃丸(水蜜丸)质量，本文参考相关文献[7-15]，建立同时测定牛黄清胃丸中大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的HPLC法，为本制剂质量控制提供更可靠的方法依据.

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10AT高效液相色谱系统，岛津SPD-10A(UV-Vis Detector)，岛津Labsolution色谱工作站.

1.2 试药

牛黄清胃丸(规格:水蜜丸，每袋7 g，长春人民药业集团有限公司)；对照品：大黄酸(批号：110757-200206)，大黄素(批号：110756-200110)，大黄酚(批号：110796-201319)，大黄素甲醚(批号：110758-201114)(均由中国药品生物制品检定研究院提供)；水为纯化水，甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯.

2 方法、结果与讨论

2.1 对照品溶液的制备

精密称取大黄酸对照品22.68 mg，大黄素对照品15.62 mg，大黄酚对照品18.42 mg，大黄素甲醚对照品13.06 mg，分别置于10 mL、50 mL、25 mL、50 mL量瓶，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀.精密量取大黄酸对照品溶液5 mL，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品溶液各10 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含226.80 μg·mL-1大黄酸、62.48 μg·mL-1大黄素、147.36 μg·mL-1大黄酚、52.24 μg·mL-1大黄素甲醚的混合对照品储备液，精密量取上述对照品储备液2.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得.

2.2 供试品溶液的制备

取本品1袋，研细，精密称取2.502 g置100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，超声提取30 min (功率125 W，频率53 kHz)，滤过，残渣用少量甲醇洗涤3次，合并滤液于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，即得.

2.3 色谱条件及系统适用性试验

用Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸(75：25)为流动相等度洗脱；柱温为30 ℃；进样量10 μL；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为254 nm.阴性对照样品(按厂家处方购置不含大黄、番泻叶的药材饮片，粉碎，精密称取约2.5 g，加甲醇50 mL超声提取30 min，过滤得阴性对照溶液)、对照品及供试品色谱图(见图1、2、3).在该色谱条件下，理论塔板数分别按大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰计算均不低于5 000，分离度均符合要求.

t/min图1 阴性对照样品色谱图

t/min图2 混合对照品HPLC色谱图

t/min图3 供试品HPLC色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围

精密量取“2.1”项下的混合对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得对照品系列溶液.按“2.3”项下的色谱条件进行测定，以峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程见表1.

表1 牛黄清胃丸回归方程与线性范围(n=5)

2.4.2 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，在2.3项下色谱条件下，重复进样6次，记录色谱图，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚RSD值分别为0.7%、0.5%、0.4%、0.6%(n=6).

2.4.3 稳定性试验

精密称取同一批牛黄清胃丸细粉，，按“2.2”的方法制备，分别于0、2、4、8、12、16、24 h测定，记录色谱图，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.6%，0.8%，0.7%，0.6%(n=7).

2.4.4 重复性试验

精密称取同一批牛黄清胃丸细粉，按“2.2”的方法制备，按“2.3”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，按外标法计算，平行进样6次，大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均含量分别为1.12、0.31、0.74、0.26 mg·g-1；RSD分别为0.4%、0.6%、0.8%、0.5%(n=6).

2.4.5 阴性对照试验

按厂家处方精密称取不含大黄、番泻叶药材的阴性对照样品细粉，按“2.2”的方法制备，按“2.3”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，结果在大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对应的保留时间处未见色谱峰，说明样品中的其他成分对上述4个成分无干扰.

2.4.6 加样回收率试验

精密称取已知含量(大黄酸1.12 mg·g-1，大黄素0.31 mg·g-1，大黄酚0.74 mg·g-1，大黄素甲醚0.26 mg·g-1)的牛黄清胃丸(批号：20151201)细粉6份，按2.2项下方法制备样品溶液，称样量减半并随机分为3组，每组2份样品，分别加入2.1项下的混合对照品储备液5.0、6.0、7.0 mL，用甲醇稀释至刻度，按2.3项下的色谱条件测定，计算回收率，结果见表2.

表2 牛黄清胃丸加样回收率试验结果(n= 6)

2.5 样品含量测定

取本品1个生产厂家共计3个批次的药品按“2.2”的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，以外标法按峰面积计算含量，结果见表3.

表3 不同批次牛黄清胃丸样品中4个成分含量测定结果(mg·g-1，n=3)

2.6 讨论

本文综合考虑牛黄清胃丸中的大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚4种成分的紫外吸收特性，在波长254 nm处，待测组分与其它杂质峰基本分离，灵敏度高，因此确定254 nm为检测波长.同时采用甲醇-0.1%磷酸作为流动相洗脱系统，通过不断的调试两相的比例，结果在甲醇-0.1%磷酸(75：25)时，4种组分得到了充分分离，且峰型良好.我们也考察了不同品牌的色谱柱，分离重现性良好.

3 结 论

大黄和番泻叶是牛黄清胃丸泻火通便功效的主要配方组分，其主要化学成分为蒽醌类化合物及其衍生物，本文利用HPLC法对其游离蒽醌主要成分大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚同时进行分析测定，该方法操作简便、结果准确，灵敏度高、重复性好，可作为牛黄清胃丸中大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚4种成分的质量控制方法.