谢美娜 李 晶 杨利霞 王云泽 樊立涛 杨国峰 徐兰举

(河北爱能生物科技股份有限公司，石家庄 050092)

皮肤是人体最大最重要的屏障性器官，主要起到保护和维持机体内环境的作用[1]。深II度以下中小面积烧烫伤是最常见的皮肤创伤性疾病，早期削痂，及时封闭创面是减轻患者疼痛提高治疗效果最关键、最有效的措施之一[2-4]。烧伤创面敷料封闭创面可抑制或减少创面微生物滋生引起的感染，维持创面湿润环境，保护和促进创面肉芽组织生长。但传统敷料因无法保持创面湿润，容易感染，且与肉芽组织粘连会造成创面二次伤害等原因，在临床应中逐渐被天然敷料、药用敷料、组织工程类敷料等新型敷料取代[5-7]。

脱细胞生物敷料是近年来发展最为迅速的天然敷料之一，它源于动物真皮组织，在制备过程中已经除去了细胞成分等免疫原性物质，生物安全性好[8]；保留天然细胞外基质结构，膜片厚度适中，柔软度和粘附性好，在烧烫伤治疗中，可有效贴附于创面，即可以起到皮肤的部分屏障功能，透气保湿，又形成相对密封的内环境，减少创面与外环境的接触，降低或减少创面二次感染风险、从而最大限度地保护间生态组织及残存的皮肤组织[6,9]；脱细胞生物膜主要成分为胶原蛋白，在体液中酶的作用下，可能会分解出氨基酸等营养物质，这可能在一定程度上促进创面修复细胞迁移、粘附、分化和增殖等，从而明显加速创面愈合[4,10]。本文通过动物实验，对比观察脱细胞生物敷料和传统敷料在治疗深II度烫伤创面的愈合情况和病理进程，说明脱细胞生物敷料对促进皮肤损伤创面愈合作用的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物、饲养环境

巴马实验用小型猪，普通级24只，雌雄不限，6月龄，体质量(15±3)kg，饲养环境为室温，湿度40%～70%，正常昼夜[11-12]。饲养方式为单笼饲养，饲养笼具为镀锌钢管笼。动物自由饮水，每头每天分两次供给其体质量5%的饲料。所有试验动物由北京通和生泰比较医学研究所提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2015-0004。动物合格证号：NO.111017000000001

1.2 主要实验仪器

Mettler-Toledo TCS-250型电子台秤(梅特勒-托利多称重设备系统有限公司，上海)；KD-2268型轮转切片机(浙江省金华市科迪仪器设备公司，浙江)；KD-TS3D型生物组织脱水机(浙江省金华市科迪仪器设备公司，浙江)；KD-BMI石蜡包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备公司，浙江)；KD-THIII型摊烤片机(浙江省金华市科迪仪器设备公司，浙江)；CX21型Olympus显微镜(奥林巴斯中国有限公司，北京);UV-5200PC型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司，上海)。

1.3 主要试剂耗材

规格5 cm×7 cm脱细胞生物敷料(河北爱能生物科技股份有限公司，河北)；脱脂棉纱布(曹县华鲁卫生材料有限公司，山东)；戊巴比妥钠(sigma，美国)；陆眠宁Ⅱ(吉林省华牧动物保健品有限公司，吉林)；苏木素(北京索莱宝科技有限公司，北京)；伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司，北京)；氯胺T(天津博迪化工股份有限公司，天津)；L-羟脯氨酸对照品(中国药品生物制品鉴定所，北京)。

1.4 实验方法

1.4.1模型制备：24只巴马实验用小型猪，实验前24 h禁食不禁水，3%戊巴比妥钠(0.5 mL/kg体质量)剂量静脉注射，进行诱导麻醉，3 min后静脉注射陆眠宁Ⅱ(0.1 mL/kg)进行麻醉。麻醉后仰卧保定，机械去毛法去除背部猪毛，清洁后酒精消毒备皮。利用铜锭制备烫伤模型[13-15]，将4 cm×6 cm的铜锭在100 ℃的水浴锅中预热，待水浴锅沸腾时，迅速将铜块置于动物一侧背部停留10 s，在小型猪背部中线两侧制作两个深Ⅱ度烫伤创面。

1.4.2实验分组: 随机分为两组，每组12只。创面制备24 h后，削痂除去坏死表皮，试验组使用脱细胞生物敷料覆盖创面，空白对照组使用脱脂棉纱布覆盖创面，分别再用无菌纱布固定包扎。分别于术后1、2、3、4周对各组进行观察，每组每个时间点取材3只。

1.4.3观察指标

1.4.3.1 临床观察：对试验组和空白对照组进行创面修复情况的临床观察。包括创面色泽、渗出液、坏死组织、创面的结痂、被毛生长情况。

1.4.3.2 创面愈合率的测定： 参照Nagelschmidt法[16-17]计算创面愈合率：使用透明的称量纸覆盖在动物的背部创面，将创面边缘和愈合创面边缘描绘在透明的称量纸上，剪去多余纸片，称得原始创面纸片质量，剪下未愈合创面纸片，称得未愈合纸片质量，计算创面愈合率。

创面愈合率(%)=(原始创面纸片质量-未愈合创面纸片质量)/原始创面纸片质量×100%。

1.4.3.3 组织病理学观察：于术后1、2、3周和4周对试验组和空白对照组的烫伤面进行病理组织学检查。对所取得的创面组织用4%甲醛溶液固定，制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察创面的修复情况，包括皮肤的修复、组织细胞的变化，并对创面的炎症细胞浸润情况进行半定量评价[18]。

表1 炎性细胞半定量组织学评价标准Table 1 Criteria for semi-quantitative histological evaluation of inflammatory cells

1.4.3.4 创面羟脯氨酸含量测定: 采用氯胺T法绘制羟脯氨酸标准曲线，并于术后1、2、3周和4周对试验组和空白对照组的烫伤面进行羟脯氨酸含量测定[19-20]。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 临床观察

整个手术观察期间所有动物全部存活，且均无创面感染情况发生。试验组术后创面干燥，2周后开始结痂，3周后开始脱痂，并且开始有被毛长出，4周后结痂与新生皮肤分离，被毛长出约2 mm；空白对照组术后1周创面表面局部有感染样渗出，其余部位干燥，2周后创面开始结痂，4周后结痂与新生皮肤开始分离，逐渐有被毛长出。

2.2 创面愈合率

经观察计算术后1周试验组的创面愈合率为(23.67±1.03)%，而空白对照组为(22.50±1.04)%，两组的创面愈合情况没有显著性差异(P>0.05)；术后2周、3周试验组的创面愈合状况明显加快，且数值比较试验组的创面愈合率显著高于空白对照组(P<0.01)。术后4周 试验组和空白对照组的创面恢复情况基本完成，两组的创面愈合率数值比较无显著性差异(P>0.05)。

表2 试验组与空白对照组的创面愈合率比较Table 2 Comparison of wound healing rate between experimental group and blank control

经统计，试验组的平均创面愈合时间为(20.83±0.75)d，空白对照组的平均愈合时间为(27.33±1.03)d，两者比较具有显著差异性(P<0.01)。试验组的平均愈合时间比空白对照组约提前6 d。

2.3 组织病理学观察

术后1周，试验组烫伤部位局部表皮剥脱，其下真皮层凝固坏死，胶原纤维变性、肿胀、排列疏松，血管扩张淤血，大量炎症细胞浸润；空白对照组与试验组病理组织学变化基本相同(图1-1A，1B)。

术后2周，试验组烫伤部位毛囊、汗腺上皮和成纤维细胞增生活跃，细胞肥大，汗腺管变实，发生痂下愈合，生成肉芽组织并向胶原纤维坏死处爬行，炎症反应降低；而空白对照组毛囊和汗腺上皮已有增生，细胞、汗腺管变化与试验组相同，且也已有痂下愈合(图1-2A，2B)。

术后3周，试验组烫伤部位肉芽组织可见新生毛细血管生成，残存皮肤附件上皮细胞长出新生上皮，开始为上皮岛，而后扩大，融合而使烫伤面愈合；空白对照组出现上皮再生，上皮岛已产生(图1-3A，3B)。

术后4周，试验组烫伤部位的皮肤各层结构清晰，表皮透明层、颗粒细胞层、棘细胞层、基底层生长良好且表皮连续覆盖于胶原纤维生成致密乳头层上；空白对照组表皮细胞层已生长，但结构界线不够清晰(图1-4A，4B)。

同时本研究对各组烫伤创面不同时间点的病理学切片按照表1中炎性细胞半定量组织学评价标准[18]对其烫伤创面部位的炎症细胞浸润情况进行观察统计，结果详见表3。术后1、2和3周炎症细胞浸润情况试验组的明显轻于空白对照组，两者比较具有显著差异性(P<0.01)。术后4周炎症细胞浸润情况两组无明显差异(P>0.05)。

表3 烫伤创面的炎症细胞浸润情况统计(n=6)Table 3 Statistics of inflammatory cell infiltration in scalded wounds(n=6)

2.4 创面羟脯氨酸含量变化

创面愈合的一个主要表现是胶原蛋白的沉积和修复，胶原蛋白的主要成分是羟脯氨酸，其在胶原蛋白含量恒定，测定创面羟脯氨酸含量可以反映其胶原蛋白含量[21-22]。各组烫伤创面不同时间点的羟脯氨酸含量变化显示，术后1周、2周实验组羟脯氨酸含量显著高于空白对照组，说明术后前两周实验组创面胶原蛋白合成显著高于空白对照组；术后3周、4周实验组羟脯氨酸含量趋于稳定，说明创面已经完成修复；空白对照组术后4周羟脯氨酸含量与实验组无显著差异，两组创面均已完成修复。综上所述脱细胞生物敷料可以加快胶原蛋白合成促进创面愈合。

表4 创面羟脯氨酸含量变化Table 4 Hydroxyproline contents of

3 讨论

中小面积Ⅱ度烧烫伤是临床常见皮肤外科损伤，伤口常累及真皮深层，渗出液多，易发生感染，患者疼痛面积大时间长。临床上Ⅱ度烧烫伤多采用纳米银+磺胺嘧啶银霜覆盖治疗，治疗过程中需要反复换药，增加患者痛苦，易造成二次创伤，治疗费用高、愈合时间长[23]。早期临床医生发现移植自体真皮组织可以抑制肉芽组织生长和疤痕生成，但自体皮肤来源有限，不适用于大面积皮肤烧伤患者[24]。Heck等[25]发现异体真皮和自体表皮复合移植于烧伤患者的切痂创面，可以减少自体皮肤用量，且移植效果比单纯的皮片移植效果好，但是异体皮具有一定免疫原性，可导致免疫排斥反应。随后，Wainwright[26]将异体皮肤经过脱细胞处理，降低免疫原性并成功用于烧伤创面并取得较好的效果。但是异体皮供体来源有限而且有传播人类疾病的可能性，所以有研究者开始探索异种脱细胞材料在烧烫伤治疗中的应用。齐顺贞等[27]研究异种与异体脱细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植和自体中厚皮移植3种移植方式比较发现临床上自体皮成活率、收缩率和瘢痕情况等效果相似，均可用于严重烧烫伤患者皮肤重建。杨红明等[28]研究发现深Ⅱ度烧伤创面早期利用选择性去细胞猪皮包扎可有效保护创面并促进创面愈合，其效果明显优于常规换药疗法。

脱细胞生物敷料经过漫长的发展过程，现在上市的脱细胞产品主要有异体皮脱细胞基质、猪源脱细胞基质、牛源脱细胞基质等[29]。LifeCell公司的Alloderm以及北京清源伟业生物组织工程科技有限公司的脱细胞异体真皮基质软组织补片均是由新鲜人尸体皮制备的脱细胞基质，该类产品存在来源有限、保存条件苛刻、传播人类疾病的可能性、价格昂贵的缺点，现在很少用于烧烫伤敷料多用于腹腔补片等[30-31]。牛源脱细胞基质上市主要有PriMatrixTM和SurgiMend®，其原材料为胎牛皮，该类产品原材料市场容量小、价格昂贵、具有海绵状脑病毒感染风险[29]。本实验中的敷料由河北爱能生物科技股份有限公司提供，是由猪真皮基质经过脱细胞和灭菌处理制备而成，主要成分是天然胶原蛋白，因不含细胞成分，所以生物相容性，免疫原性低[31-33]。该敷料原材料为猪皮，猪生长周期短、市场存栏量高，我公司按照相关法律法规从原材料源头及生产每一个步骤进行控制，保障产品无病毒/传染性病原体和极低的免疫原性[34]。

脱细胞生物敷料柔软而富有弹性，可与创面紧密贴服，减少创面渗出。敷料的天然三维结构使其具有良好的透气保湿功能，为创面修复提供适宜的微环境，在治疗过程中，一般无需揭去创面基质敷料，不会对新生肉芽组织造成二次创伤，理论上，脱细胞敷料治疗烧烫伤创面的效率要比传统治疗方法效率高。实际动物实验也证明使用脱细胞生物敷料治疗能够有效地促进创面上皮化，比传统的纱布处理方式的愈合时间至少缩短6 d，且在愈合过程不会出现排斥、坏死、渗血、感染等现象，炎症细胞浸润明显轻于传统的纱布处理方式。与用大鼠制备烫伤模型并以护创膜覆盖治疗为创面提供湿润环境加速创面愈合提高创面愈合质量的研究结果一致[35]。同时与临床上冯祥生等使用猪脱细胞真皮基质治疗深Ⅱ度烧伤的结果一致，均证明了脱细胞生物敷料有助于保护剩余的真皮组织，促进上皮化，抑制疤痕的生成，加速创面愈合[36]。

脱细胞生物敷料治疗烫伤创面主要分为3个阶段，即炎症阶段、增生阶段和重建阶段[37-39]。术后创面处于炎症阶段，炎症细胞主要包括中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等。术后创面血小板聚集并促进趋化因子、生长因子、促凝因子等细胞因子。细胞因子和炎症细胞按照一定规律协作促进创面愈合。术后1周时实验组创面主要处于该阶段，有大量炎症细胞浸润，创面开始愈合。创面愈合第二阶段是增生阶段，主要是修复细胞增殖、分化和肉芽组织形成。肉芽组织内积聚了大量的内皮细胞、成纤维细胞、生长因子等，是上皮化的支架。成纤维细胞产生足够的胶原和细胞外基质成分使伤口逐渐缩小创面，血管内皮细胞和新生的毛细血管也不断增殖迁移、融合并促进表皮再生。术后2到3周实验组创面主要处于该阶段，主要表现为成纤维细胞和毛细血管快速增殖、肉芽组织形成、创面上皮化，创面羟脯氨酸含量增高也说明创面胶原含量增高形成细胞外基质促进创面愈合。创面愈合第三阶段为重建阶段，主要是细胞外基质蛋白的沉积及重新分配与调整。皮肤中一些大分子，如胶原蛋白、纤维粘连蛋白、透明质酸等进行沉积形成骨架结构，便于其他细胞的迁移。脱细胞生物敷料治疗烫伤创面的各个阶段不是孤立的，而是相互重叠，相互交错，在机体的调控下有序、完整地进行着。

脱细胞生物敷料生物相容性好，避免了多次换药，能最大限度 地保护挽救间生态组织，可以降低超高代谢、应激反应、炎症反应综合征和烧伤感染的威胁, 使病程全过程稳定，在烫伤创面修复过程中能够有效促进创面的愈合过程、缩短愈合时间，且在治疗过程中未观察到炎症加深、细菌感染、出血、动物死亡等不良反应，一定程度上说明该脱细胞生物敷料安全性和有效性良好，为烧伤提供一种较为理想的皮肤修复方式，也为进一步临床试验提供了理论支持和试验依据。