孙协平 周广文 罗友进 韩国强 张玲玲

(1长江师范学院现代农业与生物工程学院,重庆 408100;2重庆市农业科学院果树研究所,重庆 401329)

硒(selenium,Se)是人和动物必需的微量元素,具有营养和解毒双重生物学功能,被誉为生命保护剂,在提高人体免疫力和预防癌症方面起着积极作用[1]。我国是农业大国,但超过70%的国土面积处于缺硒水平,容易导致人体硒摄入不足,使得人体免疫力下降,引发各种病症[2-3]。为了提高国民对硒的摄入量,富硒农业孕育而生,即通过硒生物转化方法,利用富硒地区丰富的硒资源或者通过根部施肥和叶面喷硒措施来发展种植业,生产富硒农产品,亦或通过喂食富硒饲料来发展养殖业,生产富硒动物产品。

随着经济社会的发展、矿产的开发和矿物废料的利用,镉(cadmium,Cd)已成为环境的主要污染物之一[4]。镉对植物的毒害作用主要表现在抑制植物生长,降低作物产量,其对人体的毒害作用主要是通过人体进食含镉植物的可食部分而影响人体健康。研究指出硒与镉存在一定的伴生关系,富硒地区存在重金属污染的威胁[5]。罗友进等[3]研究三峡库区(重庆段)发现,硒与土壤中的镉、铬、砷等均存在显著正相关。低浓度硒能够抑制重金属的吸收起到拮抗作用,通过增加蛋白质的积累(如提高谷酰基激酶活性和降低脯氨酸氧化酶活性)可减缓镉毒害导致的活性氧胁迫;高浓度硒反而促进重金属的吸收起到协同作用[5-7]。

富硒地区土壤硒含量一般介于0.4～3.0 mg·kg-1之间,我国部分地区土壤属于富硒土壤[5,8],但易被植物吸收的硒酸盐、亚硒酸盐、小分子有机硒等仅占土壤总硒量的0.4%～14.6%[9-11],其中植物有机硒的生物学功能远超过无机硒[12]。因此,富硒土壤中不一定能够生产出富硒农产品。人工强化富硒是目前生产富硒产品的主要途径。如以聚硒植物槟榔青(Spondias pinnata)(硒的主要形态为硒代甲基半胱氨酸)改良土壤能够连续几年生产出富含有机硒的西兰花和胡萝卜[13]。柑橘是世界上栽培面积最广、产量最大的果树,发展富硒柑橘生产具有重要意义。本研究通过施用小分子有机硒(硒代蛋氨酸SeMet)模拟富硒土壤,分析柑橘在硒镉伴生条件下的生长和生理变化,以期为富硒柑橘的安全生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以盆栽当年嫁接的大雅柑橘(Citrus reticulataBlanco.Daya)为试验材料,其砧木为资阳香橙(Citrus junosSieb.ex Tanaka)由重庆市农业科学院提供。塑料盆体积为10.0 L。

供试药品L-硒代蛋氨酸(SeMet)和氯化镉(CdCl2)均为分析纯,成都化夏化学试剂有限公司。

1.2 试验设计

本试验于2015年8月在重庆市农业科学院高新技术园的避雨棚中进行。供试基质为紫色壤土、草炭土以及珍珠岩,其体积比为10∶10∶1。筛选长势较好、整齐一致的盆栽大雅幼苗进行硒处理。根据前期试验结果,即香橙砧木在2.0～4.0 mg·L-1硒处理下,植株的生长指标及体内抗氧化水平较高[14],本试验设计盆栽土壤硒含量为3.0 mg·L-1。根据GB 15618 -1995[15]土壤二级污染界限,将土壤镉含量设为0.6 mg·L-1。根据盆栽土壤体积、SeMet、CdCl2的分子量计算施用量,将试剂溶解于1.0 L 水中缓慢倒入盆中,使对照(control,CK)盆栽土壤硒含量为3.0 mg·L-1,而处理的盆栽土壤硒含量为3.0 mg·L-1、镉含量为0.6 mg·L-1以模拟硒镉伴生。试验材料统一日常管理,238 d后,结束试验,采集叶片并用液氮速冻,于-40℃冰箱储存并用于相关指标的测定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长指标和干重 每个处理选4～6株整齐一致的橘苗,洗净带回实验室,测定株高、新梢总长度、新梢数量。新梢总长度为每个新梢长度的总和,新梢数量为当年萌发的新梢个数;测定后将植株分成根、茎、叶三部分,洗净擦干后105℃杀青15～20 min,60℃烘干72 h 称重。称量各器官干重后装袋储存。

1.3.2 硒和镉含量 硒和镉元素采用原子荧光光度法测定,烘干样品委托青岛科标检测研究院有限公司测定。

1.3.3 硒和镉富集系数 柑橘对硒/镉的富集系数(biological concentration factor,BCF)定义为柑橘干物质体内硒/镉的平均含量与土壤中硒/镉含量的比值。按照公式计算:

式中,Ci代表柑橘干植物体内硒/镉平均含量(根据根、茎、叶硒/镉浓度以及各器官干重计算);Cei代表土壤硒/镉的含量(土壤硒/镉含量除以土壤容重)。

1.3.4 硒和镉转运系数 柑橘对硒/镉的转运系数(translocation factor,TF)定义为柑橘叶片或茎的硒/镉含量与柑橘根系硒/镉含量的比值。按照公式计算:

式中,Cls代表柑橘叶片或茎的硒/镉含量;Cr代表柑橘根系的硒/镉含量。

1.3.5 叶绿素和过氧化氢(H2O2)含量 叶绿素和H2O2含量均采用丙酮提取法测定,具体参考蔡永萍[16]的方法。

1.3.6 抗坏血酸-谷胱甘肽循环物质与酶 还原型抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)、氧化型脱氢抗坏血酸(ascorbic acid,DHA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione peroxidase,GR)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbic acid peroxidase,APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydrogenation of ascorbic acid reductase,DHAR)均采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定,委托青岛科标检测研究院有限公司完成。

1.4 数据统计与分析

每个处理检测4个重复,利用Origin 8.5软件作图和数据分析,其中显著性差异采用LSD,显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘生长的影响

由图1可知,硒镉伴生处理的株高为61.7 cm,富硒土壤(CK)为59.4 cm;硒镉伴生处理的新梢总长度为90.4 cm,CK为98.6 cm;硒镉伴生处理的新梢数量为7个,CK为8个。硒镉伴生增加了大雅柑橘的株高,降低了新梢总长度和新梢数量,但均未达到显著水平(P＞0.05),说明硒镉伴生对大雅柑橘的生长参数影响不显著。

2.2 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘干重的影响

图1 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘株高、新梢总长度、新梢数量的影响Fig.1 Effect of Se-Cd treatment on plant height,total new shoot length,new shoot number of Daya citrus in SeMet-enriched soil

由表1可知,CK的大雅根干重为12.2 g,硒镉伴生处理的根干重为12.3 g;CK的茎干重为10.8 g,而硒镉伴生处理下降至10.7 g;CK的大雅叶干重为7.7 g,而硒镉伴生的叶干重为7.3 g。两处理根、茎、叶的干重均未达到差异显著水平(P＞0.05),表明硒镉伴生对柑橘干物质的积累影响不大。

表1 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘根、茎、叶片和总干重的影响Table1 Effect of Se-Cd treatment on root,stem,shoot,and total dry mass of Daya citrus in Se-enriched soil

2.3 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘硒和镉含量的影响

由图2-A可知,硒镉伴生处理根、茎、叶的硒含量分别为16.7、0.5、3.2 mg·kg-1,较CK 分别增加9.5、0.1、1.2 mg·kg-1,增幅表现为根＞叶＞茎,其中根和叶的硒含量与CK 差异显著(P＜0.05)。CK的柑橘镉含量为0 mg·kg-1,而硒镉伴生处理根、茎、叶的镉含量分别为2.9、0.2、0.2 mg·kg-1(图2-B),均显著高于CK(P＜0.05),增幅也表现为根＞叶＞茎。说明富硒土壤硒镉伴生条件下,镉的存在促进了硒的吸收,且镉主要分布在根系中。

2.4 富硒土壤硒镉伴生对大雅柑橘硒和镉富集系数(BCF)和转运系数(TF)的影响

由表2可知,硒镉伴生处理显著增加了硒的BCF(P＜0.05),而TF 则呈下降趋势,其中两处理硒的TF(stem/root)达到显著水平(P＜0.05)。硒镉伴生处理中镉的BCF低于硒;但镉的TF(leaf/root)低于硒,而TF(stem/root)高于硒。说明富硒土壤硒镉伴生提高了硒的富集能力,却降低了其转运能力。

2.5 富硒土壤硒镉伴生对大雅柑橘叶片色素和H2O2含量的影响

由表3可知,硒镉伴生处理增加了大雅叶片叶绿素a+b、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量,分别较CK 高17.3%、18.6%、14.5%、15.2%,其中,叶绿素a、类胡萝卜素和叶绿素a+b含量与CK 达到差异显著水平(P＜0.05);硒镉伴生处理叶片H2O2含量较CK显著增加45.5%(P＜0.05)。说明硒镉伴生促进叶片色素合成,提高了H2O2含量。

2.6 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘抗坏血酸-谷胱甘肽循环物质的影响

AsA和GSH是植物体内的抗氧化物质,在清除H2O2过程中起着重要作用。由图3可知,硒镉伴生处理的大雅柑橘叶片AsA含量较CK显著增加8.6%(P＜0.05);GSH含量较CK显著降低14.0%(P＜0.05);DHA含量较CK 增加10.0%,但未达到显著水平(P＞0.05);GSSG含量较CK显著降低7.0%(P＜0.05)。AsA/(AsA+DHA)和GSH/(GSH+GSSG)比值是反映植物体内抗氧化水平的重要参数之一,硒镉伴生处理下,AsA/(AsA+DHA)和GSH/(GSH+GSSG)比值均较CK 降低,且均未达显著水平(P＞0.05)。由上可知,硒镉伴生会影响AsA-GSH 氧化循环,但总体抗氧化水平差异不显著。

图2 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘叶片、茎和根硒和镉含量的影响Fig.2 Effect of Se-Cd treatment on Se and Cd contents of Daya citrus leaf,stem,and root in Se-enriched soil

表2 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘硒、镉富硒系数和转运系数的影响Table2 Effect of Se-Cd treatment on BCF and TFs of Se and Cd of Daya citrus in Se-enriched soil

表3 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘叶片色素和过氧化氢含量的影响Table3 Effect of Se-Cd treatment on pigment and H2O2 content in leaves of Daya citrus in Se-enriched soil

2.7 硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH)酶活性的影响

由图4可知,硒镉伴生处理APX活性较CK显著提高23.0%(P＜0.05),而GPX活性较CK显著降低了13.0%(P＜0.05);硒镉伴生处理的DHAR活性和GR活性较CK 分别显著提高了58.0%、13.0%(P＜0.05)。上述结果表明,大雅柑橘对硒镉伴生逆境环境产生了应激反应,APX、DHAR、GR 酶活性显著上升而GPX活性显著下降。

3 讨论

大量研究表明,镉胁迫会抑制种子的萌发、植株的生长以及作物产量的形成[17]。镉虽然不是植物的必需元素,但镉对一些植物生长存在剂量效应,即在一定范围内,镉能促进植物的生长。这在水稻、小麦、白菜等植物上已得到相关证实[18-19]。但植物对镉存在耐受阈值,且因植物不同而存在差异,有研究表明柑橘属于耐镉植物[20]。本研究发现大雅柑橘在富硒条件下添加0.6 mg·L-1镉并未显著降低植株的生长,这也印证了上述观点。

图3 硒隔伴生对富硒土壤大雅柑橘叶片AsA、DHA、AsA/(AsA+DHA)、GSH、GSSG、GSH/(GSH+GSSG)的影响Fig.3 Effect of Se-Cd treatment on AsA、DHA、AsA/(AsA+DHA)、GSH、GSSG、GSH/(GSH+GSSG) of Daya citrus in Se-enriched soil

硒主要具有提高植物抗逆性、调节植物生物钟、缓解重金属胁迫等显著作用[21],其生物功能不仅取决于硒浓度,而且与硒形态密切相关[22]。当硒、镉两种元素同时存在于土壤中,两种元素的含量及存在形态均是影响植物对硒镉元素吸收的决定性因素[23]。大雅柑橘对硒的吸收富集能力远高于镉,而在转运载体方面,植物根系吸收SeMet可能需要硝酸盐转运蛋白的参与[24],而植物对镉的吸收主要通过锌铁转运蛋[25-26],推测硒和镉通过不同的通道进入植物体。然而它们之间也存在一定的拮抗与协同作用,即适量浓度的硒能够降低植物镉含量,而当硒提升到一定浓度会与镉吸收有协同效应[27]。本研究中,硒镉伴生促进了富硒土壤大雅柑橘对SeMet的吸收,提高了硒的BCF,表现出一定的协同作用。硒与镉在大雅柑橘中主要储存在根系,其次是叶片和茎,可知根部是两者的主要储存部位。这与沈潇等[28]对核桃幼苗的研究结果相似,但也有一些植物吸收的镉主要储存到地上部[29],可见不同植物对镉分配有一定的差异。

硒、镉互为地球化学伴生元素,富硒地区也常伴随重金属污染。研究表明外源硒处理可通过调控抗氧化系统来缓解镉毒害作用[7]。叶绿素是判断镉损伤的一个重要生理参数[30]。本研究结果表明,在富硒土壤中,硒镉伴生处理显著提高了大雅柑橘叶片H2O2含量,叶绿素含量也呈上升趋势,这与柑橘对镉胁迫有一定的耐受性有关。Khan 等[7]研究指出镉胁迫下施用硒能够增加GR和GPX活性以降低活性氧胁迫,进而促进植物生长。GPX和APX是清除H2O2的两种主要酶类[31]。本研究中硒镉伴生处理增加了APX活性,而降低了GPX活性,这可能与本试验的土壤富含硒有关。外源硒处理能够提高植物的AsA-GSH 循环效率,进而提高其抗逆性[32]。Wu 等[33]研究表明施用外源硒能够增加GSH和AsA含量,增加GR和DHAR活性,提高AsA-GSH 循环效率;施硒能够提高香橙幼苗的生长,但不同形态硒对AsA-GSH 相关物质含量和酶活性影响差异显著[14]。本研究中,CK 较不添加硒的空白对照提高了AsA-GSH 相关物质含量和酶活性(数据未提供),硒镉互作处理增加了AsA和DHA含量,降低了GSH、GSSG含量以及AsA/(AsA+DHA)和GSH/(GSH+GSSG)的比值。在AsA-GSH 循环中,

图4 富硒土壤硒镉伴生对富硒土壤大雅柑橘叶片APX、DHAR、GPX、GR活性的影响Fig.4 Effect of Se-Cd treatment on APX、DHAR、GPX、GR activities of Daya citrus in Se-enriched soil

GPX和DHAR 消耗共同的底物GSH 既可直接清除活性氧又能够与镉结合,进而降低镉的毒害[34]。因此可以解释本研究中硒镉互作处理消耗掉一部分GSH,进而降低了GSH含量。

4 结论

本研究结果表明,硒镉伴生对大雅柑橘生长指标影响不显著,但显著提高了大雅柑橘对硒的富集能力,降低了硒的转运系数;硒镉伴生提高了富硒土壤大雅柑橘叶片叶绿素含量,同时也显著提高了H2O2含量,大雅柑橘通过调整AsA-GSH 氧化循环来维持机体的稳定性。富硒土壤存在镉胁迫威胁,但本试验未对果实进行相关研究,下一步应明确富硒条件下镉对柑橘生理参数、果实品质影响的相关机理。