顾 鑫 余凯翔 胡宏华 陈子元 叶庆富 王 伟

(浙江大学原子核农业科学研究所/农业部核农学重点实验室,浙江 杭州 310029)

近年来,抗生素和个人护理产品(Pharmaceutical and Personal Care Products,PPCPs)等残留在土壤植物系统中的生物积累和环境风险受到广泛关注[1-2]。抗生素已广泛用于人类、畜牧业及鱼类养殖的疾病预防和治疗,预计2030年食用动物的全球抗生素消费量将增加至105 596 t[3]。通过废水灌溉、粪肥或污泥还田的方式,许多具有生物活性的抗生素进入农业土壤[4-5],并在土壤和植物中被检出[6-8]。红霉素(erythromycin,ERY)是最常用的大环内酯类抗生素之一,长期的大量使用导致其在土壤、水体、底泥等环境介质中具有较高的检出浓度和频率,如在废水中检出的最高浓度为10 025 ng·L-1[9];活性淤泥中最高浓度为62.8 μg·g-1[10];鸡粪中最高浓度为1 μg·g-1[11];土壤中最高浓度为4.4 μg·kg-1,并被萝卜根部吸收浓度达到2.20 μg·kg-1[8]。由此可见,红霉素作为一种新型的土壤污染源,可能给人类带来潜在的健康风险,因此深入研究其在土壤中的环境安全性尤为重要。

土壤中的有机污染物会通过生物或非生物作用与土壤牢固结合,在不改变农药及土壤结构的条件下,不能被普通溶剂提取,即形成结合残留(bound residue,BR)[12]。土壤中有机污染物结合残留态的形成,导致其活性暂时降低,但在土壤环境条件改变的情况下又会重新释放到环境中造成延缓性药害,从而威胁农产品质量安全与环境质量[13]。释放的结合残留物去向主要有:转化为可提态残留(extractable residue,ER);在土壤中进行矿化;重新和腐殖质结合;被植物或土壤动物吸收[14]。目前,大量研究运用同位素示踪技术发现,农药会在土壤中形成结合残留,且结合残留具有生物有效性[15-16],然而关于红霉素的相关研究尚鲜见报道。因此,本研究选取广东菜心(Brassica parachinensis)为代表,研究土壤中14C-红霉素结合残留的释放、转化及生物吸收富集规律,并探讨添加外源有机肥如鸡粪与活性淤泥对该过程的影响,以期为科学评价土壤中红霉素污染的环境风险提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 标记化合物 [N-甲基-14C]-红霉素购自American Radiolabeled Chemicals,Inc,其放射性比活度为55 mCi·mmol-1,放射性化学纯度为99%,化学纯度＞98%,结构式及14C 标记位置如图1所示。

图1 14C-红霉素的化学结构式Fig.1 Chemical structure of 14C-erythromycin

1.1.2 供试植物 供试生物为广东四九菜心(Brassica parachinensis),种子购自河北省青县艾森蔬菜良种推广中心。

1.1.3 供试土壤 供试土壤采自江西鹰潭(28°13′35.09′N,116°53′54.28′E)一处农田0～20 cm 耕作层,去除植物残体和杂质,风干后磨细,过2 mm 筛备用。土壤主要理化性质:黏粒、粉粒和砂粒分别为19.6%、34.4%和46.0%,质地为壤土,pH值6.82,有机质含量36.5 g·kg-1,土壤阳离子交换浓度(cation exchange capacity,CEC)9.85 cmol·L-1,土壤最大田间持水量35.4%。鸡粪采集自安徽省黄山市黄山区甘棠镇马家村养鸡场,有机质含量为79%;活性淤泥采自安徽省宿州市砀山县经济开发区工业污水处理厂,有机质含量为70% (均不含红霉素)。

1.1.4 试验试剂 甲醇、乙腈、二氯甲烷、二甲苯和乙二醇乙醚均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。2,5 一二苯基恶唑(2,5-diphenyloxazole,PPO)、1,4-[2-(5-苯基恶唑)][1,4-bis-(5-phenyloxazol-2-yl)-benzene,POPOP]均为闪烁纯,购自上海梯希爱(TCI) 公司。闪烁液A 配方:7.0 g PPO、0.5 g POPOP、350 mL 乙二醇乙醚、650 mL 二甲苯。闪烁液B 配方:7.0 g PPO、0.5 g POPOP、175 mL 乙醇胺、225 mL 乙二醇乙醚、600 mL 二甲苯[17]。

1.1.5 主要仪器与设备 A10 超纯水系统(Milli-Q Advantage,美国);PQX-450B-30H 人工气候箱(宁波莱福特仪器);Tri-Carb 2910TR 液体闪烁测量仪(Perkin Elmer,美国);OX-501 生物氧化燃烧仪(R.J.Harvey Instruments,美国);TMFLA 9500 磷屏成像仪(Typhoon,美国);Lab-1C-80E 冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);N-1100 旋转蒸发仪(EYELA,日本);DLSB 低温冷却液循环泵(杭州大卫科教仪器);SHB-Ⅲ-A 循环水式多用真空泵(杭州大卫科教仪器);SB1200 水浴锅(EYELA,日本);DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);HZ-9610KB 恒温振荡培养箱(太仓市华利达实验设备公司);KQ-600E 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);5804R 离心机(Eppendorf,德国);XMTD-204电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司);Delta-640spH 计(Nettler Toledo,美国);BSA224S分析天平(Sartorius,德国)。

1.2 试验设计

1.2.1 红霉素结合残留土壤的制备与测定 调节土壤含水量至30% 田间最大持水量(water-holding capacity,WHC),在培养箱中避光预培养10 d,使土壤微生物复苏。用丙酮溶解14C-红霉素原药配制浓度为100 mg·L-1的母液,在10 g 土壤(干重)中加入0.25 mL 母液,充分搅拌均匀后置于通风橱,待丙酮完全挥发后分别与190 g(干重)土壤充分混合。25℃黑暗培养50 d。为获得红霉素结合残留土壤,参考Mordaunt等[18]的四步提取法去除土壤中的红霉素可提取态残留,方法如下:每5 g 土壤使用CaCl2水溶液、乙腈、甲醇和二氯甲烷各25 mL 依次提取2 次,每次按照以下步骤:振荡2 h、超声20 min、8 000 r·min-1离心10 min后合并上清液。提完的土渣风干后磨碎,-20℃冷藏备用。

将200 g14C-红霉素结合残留土壤和1 800 g 新鲜土壤(30%WHC 预培养过)充分混合搅拌,鸡粪组中鸡粪和活性淤泥组中活性淤泥的添加比例分别为5%,调节各试验组混合土壤的放射性浓度至16 640 dpm·g-1(按照红霉素母体的14C-红霉素的比活度计算为1 mg·kg-1)。再调节土壤含水量至70%后搅拌均匀,通过生物氧化燃烧仪确定土壤中红霉素结合残留物质放射性活度的均匀性(回收率95.5%±3.1%)。

1.2.2 广东菜心培养试验 将广州菜心种子放在湿纱布上黑暗25℃条件下催芽,露白后放入结合残留土壤0.5 cm 深处,在人工气候培养箱中进行植物培养。人工气候箱参数:温度L/D 25℃/18℃、光照L/D 16 h/8 h、相对湿度80%。每天通过称重补充土壤损失的水分。以未种植物的土壤为对照组(CK)。土壤-植物体系设3个处理:无添加处理(T1)、添加5%鸡粪处理(T2)、添加5%活性淤泥(T3)。

分别于播种后0、5、15、25、35、45 d 取样,对照组和试验组均设6个重复。取样后将植物样品分为地上部分和地下部分,地下部用蒸馏水反复冲洗,用滤纸吸干样品表面水分,冻干后于-20℃冰箱保存。

将植物样品(地上部分和地下部分)在生物氧化燃烧仪中燃烧4 min,燃烧条件:催化室温度680℃、燃烧室温度900℃。燃烧产生的14CO2用15 mL 闪烁液B 吸收,然后用液体闪烁测量仪测量生物体内放射性活度,经燃烧回收率和质量转化后得到植株中14C 总量。

1.2.3 土壤结合残留与可提态残留的测定 取5 g干燥土壤按照1.2.1中的连续振荡提取法提取,合并提取液,并于40℃旋转蒸发,用乙腈定容至25 mL。取1 mL 定容后的提取液,加入10 mL 闪烁液A,用液体闪烁测量仪测定其放射性活度,经回收率和质量转化后得土壤中的14C-红霉素可提态残留,记为AER;提取后的土渣置于通风橱风干并磨碎,取0.1 g 于生物氧化燃烧仪中燃烧转化,用15 mL 闪烁液B 吸收生成的14CO2,用液体闪烁测量仪测定其放射性活度,经回收率和质量转化后得土壤中的14C-红霉素结合残留,记为ABR。

1.2.4 土壤腐殖质的分级及各组分中14C-BR 测定 参考改良的丘林法进行腐殖质(富啡酸、胡敏酸和胡敏素)分级[19]。以0.1 mol·L-1NaOH与0.1 mol·L-1NaP2O7的混合溶液为提取溶剂。称取5 g 提取后的结合残留土渣,加入25 mL 提取溶剂,振荡30 min,5 000 r·min-1离心10 min,重复3 次后合并提取液(其中含有富啡酸和胡敏酸),用浓硫酸调节pH值至1～1.5,80℃水浴3～4 h,静置过夜后用滤纸过滤,所得滤液为富啡酸,滤纸上固体为胡敏酸。用浓NaOH 溶液调节滤液pH值至6.5～7.5,并定容至100 mL,吸取1 mL 加15 mL 闪烁液A,用液体闪烁仪测定其放射性活度,记为富啡酸含量(AFA)。提取后的土渣在通风橱中吹干并磨碎,经氧化燃烧法测定其中的胡敏素含量,记为AHumin。按照公式计算胡敏酸含量(AHA):

1.2.5 数据分析 试验的回收率均在90%以上,数据经过燃烧回收率校准,以平均值±标准方差表示。试验数据采用SPSS 20.0和Origin 9.0 统计软件分析和作图。

转运系数(translocation factor,TF)表示14C-红霉素及其放射性衍生物从植物根部向茎叶部分转运的能力。生物富集系数(bioconcentration factor,BCF)表示生物对土壤中红霉素残留物质的吸收能力。按照公式计算土壤中放射性红霉素残留物质的TF和BCF[20]:

式(2)中,AShoot为地上部放射性浓度(dpm·g-1干重);ARoot为根部放射性浓度(dpm·g-1干重)。式(3)中,APlant为试验生物体中放射性浓度(dpm·g-1干重);ASoil为土壤中放射性浓度(dpm·g-1干重)。

2 结果与分析

2.1 土壤中14C-红霉素结合残留的释放与转化

由表1可知,经过45 d的培养,所有处理的14C-红霉素结合残留均呈现下降趋势,说明在模拟自然条件下,土壤中14C-红霉素结合残留会逐渐释放。T1在各培养时间段的结合残留均低于CK,培养25 d和35 d时T1中结合残留分别下降至引入量的66.68%和54.15%,说明植物的吸收或扰动会促进土壤中结合残留的释放与转化。添加有机质的土壤在各采样点的结合残留含量均高于T1,培养45 d时T2和T3的结合残留分别下降至引入量的88.03%和69.82%,均显著高于T1(P＜0.05),说明添加有机肥泥会抑制土壤中红霉素结合残留的释放,导致其在土壤累积。

土壤中的结合残留会因环境因素的改变而转化为可提态残留或消失在大气环境中[21]。由表2可知,除T2的消失部分变化无明显规律以及T3可提态残留在培养35 d时上升不明显外,其他各组的可提态残留和消失部分均随着培养时间延长逐渐上升。CK 土壤在培养45 d时释放的一部分转化为可提态残留,另一部分以其他形式消失在环境中,分别占引入量的15.00%和25.17%;而T1中有31.26%的结合残留转化为可提态残留,显著高于CK(P＜0.05),说明植物根系的扰动和吸收作用能促进结合残留转化为可提态残留。添加有机质的土壤(T1、T2)中,各时期由结合残留转化而来的可提态残留和消失的部分相对较少,说明添加鸡粪和活性淤泥会抑制结合残留的转化与降解。

表1 土壤中14C-红霉素结合残留随时间的动态变化(占引入量的百分比)Table1 The dynamics of 14C-erythromycin bound residues in different soils (percentage of initial amount) /%

表2 土壤中14C-红霉素结合残留的转化(占引入量的百分比)Table2 Transformation of 14C-erythromycin bound residues in different soils (percentage of initial amount) /%

图2 土壤中14C-红霉素结合残留在广东菜心地上部(A)和地下部(B)的吸收分布动态特征(占引入量的百分比)Fig.2 The absorption of14C-erythromycin bound residues in different soils by the shoot (A) and root (B) of Flowering Chinese Cabbage (percentage of initial amount)

2.2 土壤中14C-红霉素结合残留的生物有效性

本试验中所有施药组的植物样品均检测到放射性,说明土壤中的14C-红霉素残留可以被植物吸收。由图2可知,植物对14C-红霉素残留的吸收量随着培养时间的延长呈增加趋势,且3种处理地上部和地下部的变化趋势一致。但不同处理对植物14C-红霉素的总吸收量存在影响,表现为T2＞T3＞T1,在培养45 d后分别达到引入量的1.15%、0.72%和0.47%。说明有机质的引入能促进植物对土壤中的14C-红霉素的吸收,但其含量会被生物量稀释而有所降低,如按照母体比活度计算,在培养45 d后,T1、T2、T3植物地上部和地下部的14C-红霉素浓度分别为0.11和0.16 μg·g-1,0.03和0.12 μg·g-1,0.035和0.11 μg·g-1。

计算培养45 d时14C-红霉素残留在菜心体内的生物富集系数和转运系数。由表3可知,红霉素残留在菜心根部的生物富集系数均高于地上部,说明红霉素残留容易在根部富集,这与Pan 等[8]的研究结果一致。红霉素在菜心体内的平均转运系数为0.34,表明红霉素在菜心体内不易向上运输。

表3 14C-红霉素结合残留在菜心中的生物富集系数和转运系数Table3 Bioconcentration factor (BCF) and translocation factor (TF) of 14C-erythromycin bound residues in Flowering Chinese Cabbage

图4 14C-红霉素在菜心体内的分布Fig.4 Distribution of 14C-erythromycin boound residues in Flowering Chinese Cabbage

2.3 14C-红霉素结合残留在植株与土壤腐殖质中的分布

为了研究14C-红霉素及其放射性衍生物在菜心体内的分布,选取培养45 d的菜心植株,利用放射性自显影技术进行成像,观察红霉素及其放射性衍生物的生物吸收与分布特征。由图4可知,菜心的根、茎、叶片、花与籽粒中均观察到了放射性物质,说明菜心根部吸收土壤中14C-红霉素残留后,可以将其转运到地上的各个部位。放射性物质在根和叶片中的含量较高,在叶片中沿叶脉向叶缘聚集,可能是随着蒸腾作用进行被动运输造成的,这与Hu 等[21]发现的抗生素主要通过水分运输和被动运输的方式向上运输的规律一致。14C-红霉素残留在茎、花和籽粒中的含量较低,但仍可能会对环境和人类的健康造成威胁。

培养45 d后14C-红霉素结合残留在腐殖质中分布见图5,结果表明,14C-红霉素在土壤中结合残留的分布呈现出富啡酸＞胡敏素＞胡敏酸的规律。如CK中结合残留在腐殖质分布为富啡酸42.08%、胡敏素3.29%、胡敏酸0.75%,说明红霉素在与土壤腐殖质形成结合残留的过程中,富啡酸起着最主要作用,而胡敏素和胡敏酸的作用较小。这可能是因为富啡酸表面带有大量的芳环、羧基、羰基和羟基等,且富含负电荷[22],而红霉素分子结构中-[-N(CH3)2]基团在土壤溶液中容易电离,形成红霉素阳离子,容易与14C-红霉素和/或其衍生物物通过疏水作用、偶极作用、离子交换作用以及氢键的方式结合。红霉素在施用鸡粪的土壤中结合残留量最高,且张晋京等[22]发现施用猪粪能使富啡酸的结构变得复杂和脂族化,说明外源有机肥可能为红霉素的结合提供了更多的吸附位点,从而导致红霉素结合残留的稳定性更持久。

3 讨论

3.1 土壤中14C-红霉素结合残留的转化及其影响因素

土壤中的结合残留会因为环境因素(水分、温度、pH、扰动、碳源和微生物活性)或土壤腐殖质的改变再次释放到环境中[23-24],转化为可提态残留,变成生物

图5 培养45 d后14C-红霉素结合残留在土壤腐殖质中的分布(占引入量的百分比)Fig.5 Amounts of 14C-erythromycin bound residues within humic fractions after 45 days of cullture (percentage of initial amount)

可利用部分,带来潜在的环境危害[21],也会有一些被直接矿化降解[25]。本研究发现在模拟自然条件下(有或无植物),土壤中的14C-红霉素结合残留均会再次释放到环境中,说明其释放与环境因素及植物的吸收与扰动等有关。植物体内的红霉素残留也可能存在生物降解,如红霉素在水生植物体内可以被降解[26]。本研究结果表明,结合残留一部分转化为可提态残留,且可提态残留会随着培养时间延长逐渐增加;另一部分以矿化的形式消失,这部分可能由结合残留直接矿化,也可能由可提态残留转化消失。说明土壤中的14C-红霉素结合残留在自然条件下会逐渐消减,但是重新释放到土壤中的红霉素也可能存在迁移淋溶的风险,会被植物吸收从而对人类的健康造成潜在威胁。

3.2 有机肥对土壤中14C-红霉素结合残留释放的影响

抗生素的结构[27],土壤有机质含量[28]、pH值[29]和类型[30]等都会影响抗生素与土壤的相互作用。红霉素具有-OH、-C=O、-COOH 等官能团,会与土壤颗粒或胶体产生吸附作用[28],且有机肥的施入会改变土壤的pH值、有机质含量和微生物活性等,进而对土壤中抗生素的吸附、迁移、降解等产生影响,所以施肥与土壤中的抗生素存在着密切的关系[31-32]。Wang等[33]发现粪肥的引入会促进土壤对磺胺类抗生素的吸附能力,并减少其在土壤中的流动性;唐胜华等[34]发现土壤有机质含量越高,其对红霉素的吸附能力越强,这与本研究结果类似。本研究采用的两类有机肥的有机质含量均大于70%,能增加土壤的有机质含量,可能会增强土壤对红霉素的吸附作用,从而导致结合残留的含量维持在较高水平。前人研究了红霉素通过粪肥引入土壤后的环境行为[35]。本研究在已污染土壤(形成结合残留)中施用有机肥,探究其是否影响红霉素结合残留的释放或稳定性,结果显示,外源有机肥的添加不利于红霉素残留的消减,随着有机肥的不断施入,不仅可能会引入新的污染源,而且会造成红霉素污染在土壤中的不断累积。

3.3 植物对土壤中14C-红霉素结合残留的吸收及其影响因素

本研究结果显示,栽培植物的土壤中结合残留消减速率快于无植物土壤,说明植物根部的扰动和吸收作用可能对14C-红霉素的释放存在促进作用。这可能是由于植物根系分泌物,如有机酸、蛋白酶、多糖等物质改变了土壤环境,从而对结合残留的释放和降解产生了影响。前人也得到了相似的结论,如王松凤[36]发现根系分泌物会改变结合残留在土壤中的结合方式;Gerhardt 等[37]发现植物根系分泌物能够促进有机污染物的降解;Ouvrard 等[38]发现根系释放出的有机酸可以增加聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)在土壤中的溶解性和生物可利用性。

本试验运用14C-示踪技术研究红霉素在土壤中的结合残留,其中包括红霉素母体和/或其放射性衍生物(包括脱水红霉素、脱甲基红霉素、二水合红霉素、糖胺基等),植物体内的放射性物质也包括14C-红霉素和/或放射性衍生物。植物体内的红霉素也可能发生生物降解而减少,所以用放射性含量占引入量的百分比来描述植物对土壤中红霉素残留的吸收量更为合理。如按照母体红霉素的比活度(红霉素在土壤和植物中均不发生降解转化)计算,在植物可收获期间的可食部分(地上部)浓度最高可达0.12 μg·g-1(干重)。Pan 等[8]发现在污水灌溉的土壤中红霉素被萝卜根部吸收的量达到2.20 μg·kg-1(干重),说明红霉素的分子结构较大,难以向上运输,加之红霉素容易发生生物降解,因此未在植物地上部检测到红霉素母体。此外,由于抗生素在土壤中会发生结合、降解和迁移等行为,而这些行为会限制抗生素的生物可利用性[39],所以本研究通过放射性的检测,溯源追踪14C-红霉素及其放射性衍生物在土壤和植物中的分布,能全面真实地反映植物对土壤中红霉素污染的吸收与运转过程。

本研究中土壤培养试验和盆栽试验的时间较短,土壤中14C-红霉素结合残留释放与植物吸收均未达到平衡,不能完全真实反映植物对红霉素残留的吸收。此外,结合残留不能被普通溶剂提取,所以并不能对其进行定性分析,但通过14C-示踪技术能溯源追踪14C-红霉素母体及其放射性衍生物在土壤和植物中的行为,更具有实际意义。后续可分别针对微生物、碳源、根系分泌物或其他环境因素对结合残留释放的影响进行研究,还可结合14C-示踪与现代仪器结合的方法对植物体内14C-红霉素及其产物进行定量和定性分析。

4 结论

土壤中红霉素结合残留存在释放现象,并会随着培养时间延长逐渐转化为可提态残留;红霉素结合残留在菜心中具有生物有效性,会对人类健康产生风险;对植物施用有机肥如鸡粪、活性淤泥,可促进植物对土壤中14C-红霉素吸收,并导致结合残留在土壤中的累积,存在一定的环境风险。本研究结果为科学评价红霉素的生态安全性提供了重要的数据。