夏 魏 刘 志 邵圣枝 聂 晶 李祖光 袁玉伟,∗ Karyne M.Rogers

(1浙江省农业科学院农产品质量标准研究所,浙江 杭州 310021;2 浙江工业大学化学与工程学院,浙江 杭州 310014;3 农业农村部农产品信息溯源重点实验室,浙江 杭州 310021;4新西兰GNS国家同位素中心,惠灵顿 下哈特 5040 新西兰)

在自然界,茶树作为植物的一类,可以利用水、二氧化碳以及土壤中矿物质进行光合作用以及其他生命活动,从而调节能量与物质之间的转化并维持生态环境的可持续性[4]。其中,1H和D、12C和13C、16O和18O、14N和15N 属于这些物质的基本组分,它们之间虽无明显化学性质差异,但其物理性质(气相中传导率、分子键能、生化合成和分解速率等)的差异会导致物质反应前后同位素组成产生明显变化。以某种元素的不同同位素在物质(物相)之间的分配产生不同同位素比值的现象称为同位素分馏,如水蒸气通过空气进行扩散,CO2和H2O 通过叶片气孔扩散,植物吸收和同化NO3-、NH4+等无机盐的过程等,都会发生同位素分馏现象[5-7]。而水、土壤中的矿物元素经过溶解、沉淀、凝聚、络合、吸附等过程,形成具有不同迁移转化能力和不同形态的矿物质,使得它们在自然界的种类分布和含量不同,这也决定了环境中矿物元素的差异性[8],而不同地域的茶树在生长过程中因环境的差异使其获取的矿物元素产生相应变化。因此,通过借助科学的分析方法,明确物质间存在的差异特征及其相关性具有重要意义。

目前,稳定同位素结合微量元素的分析技术已在多种农产品的产地溯源和真假鉴别方面得到了广泛应用,如橄榄油[9]、猕猴桃[10]、蜂蜜[11]、牛肉[12]和茶叶[13]等。其中,茶树是多年生经济作物,同种茶叶因生长地域不同其内在品质往往不同,这可能与其独特的地理、气候和环境有关[14]。相关研究表明,不同地域来源的动植物体内稳定同位素组成受气候、海拔、地形、水源、土壤、大气成分及动植物代谢类型等因素的影响,出现同位素分馏效应而存在差异,产生的差异性具有一定指纹特征,能够作为内在的地理标识[15-16]。如王洁等[17]采用电感耦合等离子体原子发射光谱仪

(inductive coupled plasma atomic emission spectrometers,ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱仪(inductive coupled plasma mass spectrometers,ICP-MS)

和元素分析同位素质谱联用仪(elementary analyzerstable isotope ratio mass spectrometers,EA-IRMS)对西湖、越州和钱塘的龙井茶进行测定分析,证实了不同产地茶叶中的矿物元素含量及稳定同位素比率具有地域差异性;袁玉伟等[13]利用EA-IRMS对浙江、山东和福建茶叶进行测定时发现,茶叶中稳定同位素δD和δ18O存在明显差异;Ni 等[18]采用EA-IRMS和ICP-MS对浙江、山东和贵州等多个产地的扁形绿茶进行测定分析,通过主成分分析(principal components analysis,PCA)和线性判别式分析(linear discriminant analysis,LDA)发现不同产区茶叶矿物元素和稳定同位素具有特征性,以上研究仅显示了不同产地茶叶的差异性及特征状况。也有研究指出茶叶的差异特征与外界环境密切相关,如占茉莉等[19]对不同产区的龙井茶进行近红外光谱分析,发现茶叶本身特征差异与产地气候、地理环境等因素关系密切,但未探讨茶叶与环境变量之间的关联性。

本研究拟通过对山东日照和崂山地区茶叶及其茶园土壤、灌溉水源中稳定同位素和矿物元素进行分析,比较两地区4种稳定同位素比值(δ13C、δ15N、δD和δ18O)和23种矿物元素(Na、Mg、Al、K、Ca和Sr 等)的区域特征,开展茶叶与产地环境中稳定同位素和矿物元素特征的相关性研究,旨在了解茶叶与环境因子之间的关系,为茶叶原产地溯源技术的推广应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶、栽培土壤及灌溉水源样本的采集地点为山东省日照和崂山地区,采样时间为2014年5月。其中日照茶叶和土壤样本各7个,崂山茶叶和栽培土壤样本各3个(茶叶和栽培土壤样本相对应),日照和崂山水源样本分别采集6个和3个(水源主要为当地河流和水库),样本总计29个,具体信息见表1。

表1 茶叶、土壤和水源样本信息Table1 Information of tea,soil and water source samples

稳定同位素比率分析采用国际原子能机构(international atomic energy agency,IAEA,维也纳,奥地利)的一级标准物质:CH-6(蔗糖,δ13CV-PDB= -10.449‰±0.033‰),IAEA-600(咖啡因,δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰,δ15Nair= 1.0‰±0.2‰),IAEA-601(苯甲酸,δ18OV-SMOW= 23.14‰±0.19‰),IAEA-602(苯甲酸,δ18OV-SMOW=73.35‰±0.39‰),IAEA-N-2(硫酸铵,δ15Nair=20.3‰±0.2‰),IAEA-CH-7(聚乙烯,δ2HV-SMOW= - 100.3‰ ± 2.0‰);英国Elemental Microanalysis 公司的一级标准物质:B2203(δ2HV-SMOW=-25.3‰±1.1‰)、B2155(δ15Nair=5.94‰±0.08‰),B2174(δ13CV-PDB=-37.421‰±0.017‰),进行两点法校正。氢氧化钠(NaOH)和五氧化二磷(P2O5),德国密理博公司;玻璃碳,炭黑,氧化铜(CuO)、三氧化二铝(Al2O3)、线状还原铜、锡杯和银杯(尺寸规格:4 mm×4 mm×11 mm),德国艾力蒙塔公司。

1.2 主要仪器与设备

Vario PYRO cube元素分析仪和Isoprime 100 型同位素比率质谱仪,德国艾力蒙塔公司;FW100 型粉碎机,天津泰斯特公司;CEM Mars 5 型微波消解仪,美国培安公司;X-seriesⅡ型ICP-MS,美国赛默飞世尔公司。

全诗想象奇特，虽是题画之作，却出入于画面之外。首二句用夸张之语营造一种雄阔之势，三、四句由整体转向局部，描绘出峰头秃树万笏朝天之势。中间六句通过箕山老人前后气色的转变再次凸显蓬莱峰的雄壮气势。接下来两句用“忽然”一词将观者的视线由峰顶引至海边平地。整幅画面，有万仞之高的险峰，有平如江海般的平地。一高一低，一险一缓，给人以强烈的视觉冲击。后四句由画阐发自我感悟，青峰、明月何须购买，本属万物。最后两句化用苏轼“我携此石归，袖中有东海”之句，与首句呼应。

1.3 稳定同位素比率检测

1.3.1 碳、氮稳定同位素测定 参照袁玉伟等[13]和刘志等[20]的方法,采用EA-IRMS 测定茶叶和土壤中δ13C和δ15N值。称取2.0～4.0 mg (响应度为2～10 nA)样品至锡箔杯(4 mm×4 mm×11 mm)中,包样后将样品置于元素分析仪(vario PYRO cube)中,样品中的碳元素和氮元素分别转化为纯净的CO2和N2气体,再经稀释后进入同位素质谱仪检测。具体参数:元素分析仪的氧化炉和还原炉温度分别为920℃和600℃,氦气吹扫流量230 mL·min-1;同位素质谱检测时间550 s,参考气为高纯度(＞99.999%)N2和CO2。

1.3.2 氢、氧稳定同位素的测定 参照袁玉伟等[13]和刘志等[20]的方法,采用EA-IRMS 测定茶叶和水源样品中的δ18O和δD值。称取0.3～0.6 mg 样品于银杯(4 mm×4 mm×11 mm)中,包好后置于元素分析仪中,经燃烧炉产生的H2和CO 进入同位素质谱仪进行检测。具体参数:He 流量125 mL·min-1,燃烧炉温度1 450℃;同位素质谱检测时间950 s,参考气为高纯度(＞99.999%)O2和H2。

1.3.3 稳定同位素比率计算 由于自然界中重同位素自然丰度相对极低,导致试验仪器获取的稳定同位素比率值(R)极小。国际上,通常将已知同位素比率的标准品作为参照,计算未知样本中稳定同位素比率的相对值。计算公式为:

式中,R样品为所测样品中重同位素与轻同位素的丰度比,即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H;R标准为国际标准样品中重同位素与轻同位素的丰度比。

测试数据均采用两点校正法定值,即δ13CV-PDB采用IAEA 稳定同位素比率初级标准品CH-6、IAEA-600 进行两点法校正,δ15Nair采用IAEA-N-2、IAEA-600标准物质校正,δ18OV-SMOW采用IAEA - 601、IAEA-602标准物质校正,δ2HV-SMOW采用B2203、CH-7标准物质校正。

1.3.4 矿物元素的测定 参照邵圣枝等[21]的方法。称取0.4～0.6 g 样品于微波消解内罐中,加入4.0 mL硝酸(2.0 mol·L-1),静置10 h 以上,待消解完全;再加入2 mL 双氧水,20 min后,加盖套防爆外套,进微波消解仪,采用温度控制模式,先升温至120℃保持5 min,然后升温至185℃保持30 min,再升温至190℃保持5 min,结束待冷却后,取出内罐,开盖置于专用石墨加入器中,然后进行赶酸处理,将待测样品蒸至快干时,加入0.5 mL 去离子水,如此反复2 次,至样品蒸至快干时,取下冷却,加入适量1%稀硝酸,在加热板上溶解剩余残渣,用超纯水将消解液转至25 mL 离心管中,定容后过滤,采用ICP-MS 进行测定,用铑和铼作内标溶液(1 ng·mL-1) 进行监控和校正仪器漂移。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2016 整理数据并制图,采用SPSS 21.0软件进行显著性分析(P＜0.05),热图采用Matlab 2009b软件制作。

2 结果与分析

2.1 茶叶、土壤和水源中4种稳定同位素比率特征

稳定同位素特征分析是基于同位素的自然分馏效应,主要受环境、地形、气候、土壤和生物代谢类型等影响而发生不同的分馏作用,利用同位素的比率差异揭示某部分区域特征[15-16]。由表2可知,日照和崂山两地茶叶稳定同位素δ13C 差异不大,同位素值比率的变化幅度为0.1‰,而日照茶叶中δD和δ18O 高于崂山,差值分别为3.9‰和1.9‰,具有一定的差异特征,两地区δ15N值呈现较大的差异,日照和崂山分别为4.8‰和2.9‰;在栽培土壤样本中,崂山地区的δ13C略高于日照,δ13C 差值为1.6‰,两地δ15N 差异较大,日照和崂山δ15N 分别为0.7‰和7.0‰;两地区水源的δ18O 差异较小,差值仅为0.3‰,日照δD 低于崂山,δD 差值为5.3‰。在日照和崂山茶叶样本的4种稳定同位素分析中发现只有δ13C 具有显著差异(P=0.045),可作为两地区产地判别的依据。

表2 茶叶、土壤和水源中4种稳定同位素比率特征Table2 Four stable isotope ratio signatures of tea,soil and water source

2.2 茶叶、土壤和水源中矿物元素含量特征

茶叶中矿物元素含量主要与其生长的土壤环境和人类生产活动(施肥、喷药等)密切相关[22]。由表3可知,两地区的茶叶、栽培土壤和灌溉水源中23种矿物元素含量各不相同。在两地区的栽培土壤样本中,6种常量矿物元素(Na、Mg、Al、K、Ca、Fe)的含量相对较高,范围为2.18～41.18 g·kg-1。其中,日照地区栽培土壤样本中Mg、Ca、Fe 矿物元素含量高于崂山,但Na、Al、K元素含量差异不大。两地区的栽培土壤中其余17种微量元素(Li、Be、Mo、Ag 等)的含量均低于1 g·kg-1,其中矿物元素Mn、Pb、Rb 等含量差异不明显,只有V 在两地差异较大。两地区茶叶中,K含量最高,范围为17.46～19.19 g·kg-1,其次是Mg、Ca和Mn,含量范围为0.91～2.99 g·kg-1,其余微量矿物元素含量均低于0.25 g·kg-1。对比发现,日照地区茶叶中K、Ca、Ga、Zn和Cr 等矿物元素含量高于崂山,而日照地区茶叶中Mg、Ni、Cu 等矿物元素含量则低于崂山。两地区茶叶中Na含量差异显著(P＜0.05),含量分别为0.11和0.03 g·kg-1,其他多数矿物元素差异不显著(P＞0.05)。两地区水源中仅有Na、Mg、Al、Ca和Cr 等矿物元素具有一定的区域性差异,如两地区水源中Mg元素含量分别为9.48和7.57 g·kg-1,但多数矿物元素含量较低,不适合作为产地特征对比元素。

2.3 茶叶中稳定同位素和矿物元素与其茶园土壤、灌溉水源相关性分析

由图1-A可知,茶叶与土壤δ13C值的相关系数R2仅为0.289 5,仅呈微弱的相关性;由图1-B可知,茶叶与土壤δ15N值的相关系数R2为0.450 7,呈现一定的相关性;由图1-C、D可知,茶叶与灌溉水源δD和δ18O值相关系数R2分别为0.021 4和0.156 2,均无明显相关性。在茶叶和土壤中4种稳定同位素具有不同的相关性,如图2所示,茶叶中δ18O与土壤中δ13C 呈较强正相关,而与土壤中δ15N 呈较强负相关。同样,矿物元素在茶叶与土壤中具有不同的累积规律,如茶叶中Cu与土壤中Rb,以及茶叶中Mo和Cs与土壤中Cd均呈较强正相关;而较多矿物元素在茶叶与土壤之间呈较强负相关,如茶叶中Sr、K、Fe、Ba与土壤中Na、Ca、Cr、Co 等元素,土壤中K、Be、Mo与茶叶中Mg、Al、V、Co、Fe 等元素均呈负相关。

3 讨论

通过对茶叶和土壤中矿物元素的相关性研究可知其富集性和排他性。本研究结果表明,在同种矿物元素分析中,茶叶与土壤中Cd、Li、Co、Sr、Mo 具有一定相关性,进一步分析可知茶叶和土壤中Cd、Li 共存性较强,而Co、Sr、Mo 共存性较弱;在不同种矿物元素分析中,土壤中Rb与茶叶中Gu、Zn,以及土壤中Cd与茶叶中Mo、Cs 共存性较强,而土壤中Mg、Mn与茶叶中K、Na 无明显关联。李红英等[22]研究发现小麦和玉米中Cu、Cd与相应土壤中该元素相关性较强(R2＞0.7),鹿保鑫等[23]在大豆8种微量元素研究中发现同一产地的大豆与相应土壤中K、Ca、Zn、Cu、Mn 具有显著相关性。本研究与李红英等[22]的研究结果一致,即在同种矿物元素的分析中,茶叶和土壤中Cd 相关性较强,但与鹿保鑫等[23]的研究结果存在差异,即未发现茶叶和土壤中Cu 具有较强相关性,这可能是由于两者为不同植物,且茶树是多年生植物,大豆、玉米和小麦是一年生植物,植物生命周期不同也会导致其生理代谢产物不同。

表3 茶叶、土壤和水源中23种矿物元素的含量Table3 Content of 23 mineral elements in tea,soil and water

茶叶生长过程中,通过植物体光合作用吸收空气中CO2合成有机物,因而植物体中C 同位素比值理论上与空气CO2中C 同位素比值相同。但研究发现,土壤中有机质微生物分解产生的烃类气体(如甲烷)和无机碳酸根离子(如CO32-,HCO3-等),也能作为植物光合作用的可用碳源。因此,探讨茶叶与土壤中C 同位素的相关性,能够深入了解茶叶植物体光合作用过程中C 同位素的生态循环机理。本研究通过热图多重相关性分析发现,茶叶与栽培土壤中δ13C 呈较弱负相关,与水源中δ18O 几乎无相关性,可见茶叶中C、O元素与相应栽培土壤、水源无密切关系。由此可知,土壤中微生物活动和无机碳源在茶叶光合作用中所占比重不大,植物体中C 主要来源于光合作用过程吸收的CO2。且由植物光合作用原理可知,CO2是暗反应阶段合成有机物(多糖类)的重要物质,H2O 参与光反应生成的O2被释放于外界空气,由此推断,茶叶中转化累积的O元素不是主要来源于H2O,而是来源于CO2,此研究结果与植物光合作用反应机理相符合。

N是植物重要的生源要素,植物体吸收环境介质中含NO3-的无机盐类物质,通过生物固氮合成有机物和氨基酸,但在此过程中N 同位素分馏较小。在日照和崂山茶叶的研究中对其N 稳定同位素值特征进行分析,发现两地区栽培土壤的δ15N值差异较大,主要归因于产地间农业活动(施肥种类、茶树年龄)的差异。茶叶与栽培土壤中δ15N值呈现一定的相关性,可知茶叶中N 同位素与栽培土壤关系密切。据文献报道,农作物中15N 主要来源于栽培土壤,施用人工合成肥料会使农作物中15N 贫化,不同茶园间施肥方式和栽培时间不同,会导致不同地域间茶叶的δ15N 出现差异[24-26]。

图1 茶叶与土壤(δ13C,δ15N)和水源(δD,δ18O)中稳定同位素的相关性Fig.1 Correlation of stable isotopes ratios of tea with soil (δ13C,δ15N) and water (δD,δ18O)

H、O 同位素主要受大气蒸发、植物蒸腾等物理过程分馏的影响,其中,O 同位素还受植物体光合作用和呼吸作用以及空间上纬度效应、大陆效应和高度效应的分馏影响[27]。本研究结果表明,两地区灌溉水源中δ18O 差异不大,可能是由于日照和崂山地理位置相近,导致δ18O 分馏效应较弱。茶叶与灌溉水源中δD和δ18O 几乎无相关性,但有研究报道,植物体的水一般通过河流、地表水直接获取,但本研究结果未直接反映出此现象,这可能是由于植物体吸收灌溉水后,其叶片蒸腾过程对H 同位素的分馏影响较大,而叶片光合作用和呼吸过程对O 同位素的分馏影响更为显著,导致灌溉水源与植物体中H、O 同位素比率不一致[28-29]。相关研究表明,H、O 同位素参与大气、水循环程度较高,影响其分馏因素较多,如降雨、经纬度、海拔高度和离海岸距离等,这些因素都易造成区域之间H、O 同位素的天然分馏,引起植物体获取的H、O 同位素出现差异[20,30]。因此,进一步探究气象因子和空间尺度对茶叶中稳定同位素分馏影响具有一定的价值。

4 结论

本研究通过测定茶叶及其茶园土壤和灌溉水源中4种稳定同位素比率(δ13C、δ15N、δD和δ18O)和23种矿物元素含量(Na、Mg、Al、K、Ca和Sr 等),探讨日照和崂山两地区茶叶、栽培土壤和灌溉水源中稳定同位素及矿物元素的特征差异及相关性。结果表明,两地区的茶叶及其栽培土壤和灌溉水源中稳定同位素比率及矿物元素含量具有一定的差异,茶叶与栽培土壤中Cd、Li、Co、Sr、Mo 具有一定相关性,为茶叶稳定同位素及矿物元素产地溯源提供了数据支持。此外,茶叶稳定同位素δ15N值与栽培土壤的δ15N 相关性最大(R2=0.450 7),而δ13C、δ18O和δD 呈现较低的相关性,R2分别为0.289 5、0.156 2和0.021 4。茶叶中稳定同位素δ18O 主要来源于空气中CO2,而非灌溉水源,揭示了茶叶的生长过程中氧稳定同位素的直接来源,但与其灌溉水源无明显关系。本研究对探讨茶叶、土壤和水源间稳定同位素和矿物元素含量的相关性,阐明茶叶与产地环境因子间的相互影响和茶叶产地溯源技术应用具有重要意义。

图2 茶叶、土壤和水源中稳定同位素及矿物元素的相关性Fig.2 Correlation of stable isotopes and mineral elements between tea,soil and water source