黄倩雯，陈海雷，黄 燕，沈妙娜，刘 勇

中山大学孙逸仙纪念医院儿科血液室，广东广州 510120

儿童白血病在儿童恶性肿瘤中所占比例最高，且发生率呈逐渐上升趋势[1]。目前采用MICM分型对初诊患儿进行实验室诊断和分型，使白血病的诊断从细胞形态学水平上升到分子生物学水平，不仅对研究白血病发病、复发、耐药机制和生物学特征有重大意义，而且对指导临床治疗和判断预后也有实用价值[2]。本研究对223例初发或复发的血液肿瘤患儿进行回顾性分析，以明确30种融合基因筛查在儿童白血病肿瘤中的分布情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 对2017年5月至2019年4月本院223例初发或复发白血病患儿进行回顾性分析，其中男124例，女99例，年龄1个月至14岁，平均(5.5±3.2)岁。采用实时荧光探针PCR进行融合基因检测，包括急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓系白血病(AML)常见的如BCR-ABL1、AML1-ETO、CBFβ-MYH11、MLL和PML-RARα相关等30种融合基因，见表1。

表1 PCR反应液及融合基因检测

续表1 PCR反应液及融合基因检测

1.2方法

1.2.1免疫分型和细胞遗传学 选取肝素钠抗凝骨髓2～3 mL，予PBS清洗2遍后进行计数，每管控制细胞数在5×105～1×106个，采用四色直接免疫荧光法标记，包括B系、T系和髓系的常用抗体，如CD3、CD8、CD19、CD20、CD33和CD117等40种，采用流式细胞仪FACSCalibur(美国BD公司)进行标准化检测。同时进行染色体核型分析和FISH探针分析，包括N-MYC、TCF-PBX1、ETO-AML1、PML-RARα、CBFβ-inc(16)、MLL、BCR-ABL、TEL-AML1、CCND-IgH、ALK和MALT1等。

1.2.2RNA提取及浓度测定 取EDTA抗凝骨髓200 μL，按照TIANGEN医药有限公司的RNA提取试剂盒说明书进行总RNA提取，使用nanodrop测定RNA浓度，其A260/A280应在1.9～2.1，A260/A230≥2.0，浓度应>0.02 μg/μL。

1.2.3反转录 采用厦门至善生物医药有限公司的30种白血病相关融合基因试剂提取盒进行检测，首先将反转录试剂及LF Positive Control裂解，然后配制反转录体系，将配制好的反转录体系按照37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s条件进行反转录，反转录完毕后，取10 μL反转录产物加入40 μL H2O，经该试剂盒中内参检测Ct值≤30时，该标本RNA的转录产物cDNA方可进入后续的融合基因相关检测。

1.2.4检测体系配制 取出试剂盒中各种反应液室温融化，并振荡混匀后，离心数秒，每个样品使用A～H 8管PCR mix检测。根据样品数量n，分别配制8管mix。取n×19.8 μL mix和n×0.2 μL LF polymerase加到1.5 mL离心管中，振荡混匀数秒，离心。将配好的A～H 8管mix分别以20 μL分装于PCR管中。取5 μL稀释好的样品或阴、阳性对照cDNA加到每个PCR反应管中，离心数秒。

1.2.5PCR扩增与分析 采用ABI7500仪进行PCR扩增，扩增条件为：预变性50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min；Touchdow循环：95 ℃ 20 s，65 ℃ 1 min(每个循环下降1 ℃)，72 ℃ 1 min，10个循环；PCR循环：95 ℃ 20 s，56 ℃ 32 s(4通道采光，FAM、HEX、ROX、Cy5)，72 ℃ 1 min。扩增结束后在扩增曲线界面进行分析。以软件默认设定3～15个循环的平均荧光信号为基线，在阴性对照无扩增情况下，阈值设定在无扩增曲线样本的最高点，且以阴性对照未检出为原则，确定起始阈值。

2 结 果

2.130种融合基因筛选诊断情况 223例初发或复发白血病患儿进行30种融合基因筛选，综合MICM国际通用的细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学分型标准最终诊断分布为：B-ALL 152例，T-ALL 9例；AML 49例；其他13例，分别为非霍奇金淋巴瘤B系(B-NHL)2例，非霍奇金淋巴瘤T系(T-NHL)1例，混合型急性白血病1例，分类不明急性白血病2例，幼年型粒单核细胞白血病(JMML)1例，慢性粒细胞白血病转AML1例，慢性粒细胞白血病(CML)5例。

2.2融合基因阳性分布特点 223例患儿中融合基因阳性率为43.0%(96/223)，其中B-ALL阳性率为32.2%(49/152)，T-ALL阳性率为22.2%(2/9)；AML阳性率为75.5%(37/49)；其他病例阳性率为61.5%(8/13)。ALL中最常见的融合基因阳性率分别为：TEL-AML1 15.5%(25/161，BCR-ABL1 4.3%(7/161)，E2A-PBX1 3.7%(6/161)，AML-MTG16 1.9%(3/161)，MLL-AF4、MLL-AF10、MLL-ENL、TLS-ERG、MLL-AF6均为1.2%(2/161)；AML中最常见的融合基因阳性率分别为：AML1-ETO20.4%(10/49)，PML-RARα16.3%(8/49)，CBFβ-MYH11 10.2%(5/49)，DEK-CAN6.1%(3/49)，MLL-AF10 8.2%(4/49)，MLL-AF4、MLL-AF9、MLL-AF1p、NPM-MLF、TEL-ABL、SET-CAN、BCR-ABL1均为2.0%(1/49)。SIL-TAL1见于B-ALL，而MLL-AF4和MLL-AF10在ALL和AML中均可出现。

2.3融合基因与免疫分型的关系 分别选取本研究中ALL和AML最常见的两种融合基因TEL-AML1和AML1-ETO，对其免疫分表型进行分析发现，24例TEL-AML1阳性病例中有22例免疫表型为com-B-ALL,仅2例为Pre-B-ALL，共同特点为CD45阴性，TdT阳性，无跨系表达；10例AML1-ETO阳性病例中有2例伴CD19跨系表达。

2.4融合基因与染色体核型分析和荧光原位杂交(FISH)的结果比较 96例融合基因阳性患儿同时进行染色体和FISH检测，染色体结果为异常核型43例，正常核型35例，另外18例因无分裂象等原因无结果；而FISH结果中58例异常，26例正常，12例无结果。在共同阳性的病例中，3种方法学融合基因和易位结果均一致。

3 讨 论

过去几十年，通过建立白血病危险因素和研究其生物学机制，儿童整个生存期已大为改善，分子遗传学从基因途径提供了有益信息。大部分白血病存在染色体结构异常，包括缺失、重复、倒位、易位等，导致原癌基因及抑癌基因结构变异，原癌基因激活或抑癌基因失活，产生新的融合基因，编码融合蛋白。有些基因是调控细胞增殖、分化和凋亡的转录因子，当基因发生变异时，产生白血病表型，直接影响下游信号传递途径，导致细胞增殖能力增强、凋亡障碍、分化障碍等[3]。

有文献报道，约有85%的儿童白血病可检测出克隆型染色体异常，其中平衡性易位最为常见，并导致融合基因产生，融合基因特定易位的存在已证实在白血病的恶性转化过程中起重要作用[4]。融合基因的检测有助于儿童白血病的危险分层，判断预后，并有助于选择合适的化疗方案。儿童急性淋巴细胞性白血病中，最常见的是t(12；21)(p13；q22)染色体易位，形成融合基因TEL-AML1，其余较常见的如t(4；11)(q21；q23)染色体易位，形成MLL-AF4,婴儿白血病发生率达60%以上[5]；t(1；19)(q23；p13)染色体易位形成E2A-PBX1，检出率为5.8%[6]；t(9；22)(q34；q11)染色体易位形成BCR-ABL1，检出率为3%～5%[7]。有研究表明，E2A-PBX1、BCR-ABL1与MLL-AF4转归类似，多数预后较差，并与疾病初诊时的高白细胞计数和年龄偏大相关[8]。

根据文献报道，MLL融合基因的多样化是由于MLL伙伴基因可与30多种不同基因发生融合，常见的两种MLL融合基因AF9和AF4在ALL和AML中均可发现，其中AF9常见于白血病M4、M5型，偶见于M1、M2型[9]。本研究中融合基因AF4和AF10阳性率较AF9高，且在ALL和AML中均有发生，AF9阳性只见于1例诊断为M4的患者中。MLL-AF10在ALL和AML中均有发生，其发病机制少见报道。TLS-ERG融合基因为较罕见的融合基因之一，在ALL和AML患儿中均可发生，根据北京儿童医院血液肿瘤中心统计数据显示,该融合基因在儿童新诊治的白血病中发生率仅为0.7%，对于ALL患儿的治疗及预后影响不大，但伴有TLS-ERG融合基因的AML患儿治疗困难，预后较差[10]。90%以上的CML患者存在Ph染色体及BCR-ABL1融合基因，治疗关键在于慢性期是否能获得分子水平的缓解，以甲磺酸伊马替尼为代谢的酪氨酸激酶抑制剂，是CML的一线治疗药物[11]。

国外文献报道，AML1-ETO常常伴有CD19表达[12]，本研究24例TEL-AML1病例中其免疫表型22例为com-B-ALL，且CD45阴性，TdT阳性，说明该融合基因可能仅出现在白血病的某一分化阶段；而AML1-ETO常常伴有CD19的表达，与文献[12]报道一致，因此通过确认免疫分型的结果可预判推测某种融合基因阳性。

综上所述，融合基因对白血病的诊断、鉴别诊断及危险分层、预后评估、靶向治疗均有重要指导意义，重视并加强对白血病30种融合基因的检测，有助于提高儿童白血病的诊治水平。