张延涛 孙勇 张远鹏

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，研究显示，全球每年有大约130万新增乳腺癌患者，其中约50万乳腺癌患者死亡，病死率居女性恶性肿瘤前列[1]。目前乳腺癌发病率仍以3%的速度不断增加，且呈现出年轻化趋势，严重威胁女性的身体健康[2]。手术联合放疗、化疗仍是治疗乳腺癌的有效措施，一定程度上降低了该病的病死率，但对于部分晚期患者的治疗仍未达到满意效果[2]。研究表明，对乳腺癌预后的准确判断是提高乳腺癌治疗效果的关键[3]。然而乳腺癌的发病机制是一个多因素、多基因参与的复杂的过程，目前仍缺乏有效的生物标志物来反映乳腺癌患者的预后[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200 nt的非编码RNA，lncRNA具有一系列生物学功能，在表观遗传调控、细胞分化调控、细胞周期调控等多种生命活动中均发挥重要作用，可能作为肿瘤学临床应用的基础。小核仁RNA宿主基因12(small nucleolar RNA host gene 12，SNHG12)是一种具有低编码概率的lncRNA，与胶质瘤等多种肿瘤患者的临床特征有关，可能作为肿瘤预后的良好指标[4]。然而lncRNA SNHG12与乳腺癌疾病的发生发展及预后的关系尚不清楚。基于此，本研究通过探讨SNHG12在乳腺癌中的表达水平，分析其临床意义，以期为乳腺癌的治疗及预后提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2012年1月至2013年10月在我院行手术切除的85例乳腺癌患者的癌组织及相应癌旁组织(距癌组织边缘>5 cm处)，患者均为女性，年龄30～78岁，平均年龄(50.42±18.65)岁。本研究经医院伦理委员会审核批准。手术切除组织后，用0.9%氯化钠溶液洗去血污，迅速冻存于-80℃液氮之中保存备用。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①符合乳腺癌诊断标准[5]；②经影像学及病理学确诊；③患者术前未经任何化疗、放疗或其他抗肿瘤治疗；④患者自愿参与、配合本研究，并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①心、肝、肾等重要脏器功能障碍患者；②精神精疾病患者；③严重呼吸系统、循环系统疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂与仪器：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、RNA提取、焦碳酸二乙酯等试剂均购自赛默飞世尔科技有限公司，反转录试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，Thunderbird SYBR qPCR Mix购自北京百灵克生物科技有限公司，内参β-actin的引物探针由上海生工生物有限公司合成。

1.3.2 RNA的提取：取乳腺癌组织及对应癌旁组织3 mm2的样本解冻后，超声匀浆，加入1 ml Trizol试剂，充分混匀并静置10 min，加入300 μl氯仿并混匀，4℃、15 000 r/min离心机上离心10 min，弃上清，再加入等体积异丙醇，室温静置10 min，离心后弃上清，静置15 min，晾干后加入焦碳酸二乙酯水溶解，琼脂糖凝胶电泳后，测定RNA浓度及纯度。

1.3.3 qRT-PCR：提取RNA并测定RNA浓度后，使用反转录试剂盒反转录得cDNA，采用Thunderbird SYBR qPCR Mix进行qRT-PCR检测SNHG12的表达水平，反应体系20 μl，qRT-PCR反应条件：95℃：1 min；95℃：30 s；60℃：40 s，共40个循环。每个样品设3组重复，采用2-ΔΔCT法对SNHG12表达水平进行定量分析。见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 随访 随访日期自手术之日起至2018年10月31日，对所有患者进行复查或电话随访，随访时间为5年，记录患者随访期间的生存情况。

2 结果

2.1 lncRNA SNHG12在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达水平比较 乳腺癌组织中lncRNA SNHG12表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

类别lncRNA SNHG12乳腺癌组织2.84±1.06癌旁组织 1.07±0.52t值13.821P值0.000

2.2 lncRNA SNHG12表达与乳腺癌临床病理特征的关系 以乳腺癌患者lncRNA SNHG12水平平均值为分界线，高于平均值为高表达，低于平均值为低表达。乳腺癌组织中lncRNA SNHG12表达情况与患者肿瘤直径、淋巴结转移及雌激素受体(ER)有关(P<0.05)，与患者年龄、组织学分级、临床分期、远处转移、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体(Her2)无关(P>0.05)。见表3。

2.3 影响乳腺癌患者预后因素的Cox回归分析 Cox模型单因素分析结果显示：肿瘤直径、淋巴结转移、lncRNA SNHG12是影响乳腺癌预后的危险因素；Cox模型多因素的分析结果显示：肿瘤直径、淋巴结转移、lncRNA SNHG12是影响乳腺癌预后的独立危险因素。见表4。

2.4 lncRNA SNHG12表达水平与乳腺癌患者预后的关系 术后随访5年，共有15例患者死亡，其中lncRNA SNHG12高表达乳腺癌患者的5年总存活率为72.34%显著低于低表达患者5年的总存活率92.31%，差异有统计学意义(χ2=5.614，P=0.018)。见图1。

3 讨论

乳腺癌是临床常见的一种恶性肿瘤，是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，发生部位为乳腺上皮组织，其主要临床表现为乳腺肿块、乳头溢液、皮肤改变、乳头乳晕异常及腋窝淋巴结肿等[6]。据统计，乳腺癌约99%患者为女性，约1%患者为男性，我国乳腺癌患者占全球乳腺癌女性患者的23%，略小于发达国家的27%[7]，近年来我国乳腺癌的发病率随年龄的增长不断增加，且有年轻化的趋势，已成为威胁女性健康的第一大杀手，因此乳腺癌的防治研究已成为我国恶性肿瘤防治研究的重要任务[8]。然而乳腺癌的病因至今尚未完全清楚，研究表明，25岁以上女性、乳腺癌家族史、乳腺腺体致密、月经初潮早、绝经迟、未婚、未育、晚育、未哺乳、长期服用外源性雌激素长期过量饮酒等因素是导致乳腺癌发生的危险因素[9]。通过基因组学研究发现，乳腺癌的发病机制与原癌基因、抑癌基因及相关编码蛋白质的改变有关，端粒酶激活原癌基因及抑癌基因失活可能引发一系列复杂的多基因、多阶段协同作用的过程，进而导致乳腺癌的发生[10]。因此，通过研究分析乳腺癌相关肿瘤标志物不仅可以研究乳腺癌的发病机制，还可以对其预后情况作出判断，从而采取一定的治疗措施，提高患者生活质量，降低患者病死率。

表3 SNHG12与乳腺癌临床病理特征的关系 例(%)

表4 影响预后因素Cox回归分析

图1miR-155-5p、ELK3表达水平与乳腺癌患者预后的关系

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，没有蛋白质编码能力，lncRNA异常表达参与多种生物调节过程，如胚胎发生、干细胞多功能性、细胞生长和恶性肿瘤发生。lncRNA表达水平可能与肿瘤患者的预后相关，可能作为肿瘤疾病的诊断和预后的生物标志物[11]。lncRNA SNHG12是一种被鉴定为在肿瘤患者中表达上调的新型lncRNA，在癌细胞增殖和迁移中发挥重要作用。Wang等[12]研究表明结直肠癌组织中SNHG12表达上调，且lncRNA SNHG12可促进结直肠癌癌细胞的增殖，抑制癌细胞的凋亡，可能是一种有用的生物标志物。Ding等[13]研究表明乳头状甲状腺癌患者癌组织和细胞中lncRNA SNHG12表达上调，且lncRNA SNHG12表达水平能够调节癌细胞的增殖和转移。本研究结果显示，乳腺癌组织中lncRNA SNHG12表达水平显著高于癌旁组织，提示lncRNA SNHG12可能与乳腺癌疾病的发生有关。可能是一种潜在的生物标志物。

目前已知影响乳腺癌患者治疗疗效预测及预后的影响因素主要有病理学和生物学因素两类，临床病理学因素有年龄、组织学分级、临床分期、远处转移、淋巴结转移、肿瘤大小等[14]。生物学因素指标有ER、PR及Her2的状态等。Zhang等[15]研究表明lncRNA SNHG12在胃癌患者癌组织中表达显著上调，其表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移等密切相关，SNHG12高表达患者存活期短，提示lncRNA SNHG12可能是胃癌患者预后的新的潜在生物标志物。Wang等[16]研究表明三阴性乳腺癌的lncRNA表达谱中，lncRNA SNHG12表达量显著上调，其表达水平与肿瘤直径与淋巴结转移显著相关。本研究结果显示乳腺癌组织中lncRNA SNHG12表达情况与患者肿瘤直径、淋巴结转移及ER有关，提示lncRNA SNHG12表达水平与乳腺癌患者临床特征有关，其表达上调可能提示不良预后。本研究术后随访5年结果显示，共有15例患者死亡，其中lncRNA SNHG12高表达乳腺癌患者5年总存活率为72.34%，显著低于低表达患者5年总存活率92.31%，提示lncRNA SNHG12高表达与不良预后有关，可能作为乳腺癌预后的良好指标。本研究进一步通过Cox模型多因素分析结果显示，肿瘤直径、淋巴结转移、lncRNA SNHG12是影响乳腺癌预后的独立危险因素，提示lncRNA SNHG12可能对评价乳腺癌患者预后具有重要价值。

综上所述，乳腺癌组织中lncRNA SNHG12表达上调，且其表达水平与患者的肿瘤直径及淋巴结转移等临床病理特征有较大关系，提示lncRNA SNHG12表达水平对评价乳腺癌患者预后可能具有重要的参考价值，可能成为乳腺癌患者不良预后的生物标志物。然而本研究的样本数量较少，下一步准备扩大样本继续进行深入的研究，以期为乳腺癌的临床治疗提供一定的参考依据。