岑小宁 黄许森 韦维 黄海舸 兰海生

结直肠癌是我国成人常见的恶性肿瘤，每年新增约40万病例，略高于发达国家(3%～4%)，严重威胁我国人民的健康和生命[1]。目前结直肠癌的发生机制尚未明确，普遍认为与年龄、生活习惯、体内激素变化和环境等因素有关[1,2]。由于结直肠生理位置特殊，早期癌变不易诊断，而早期诊断对癌症的有效治疗具有重要意义，因此深入探讨结直肠癌的发病机制对结直肠癌患者的早期诊断、治疗以及提高结直肠癌患者的生存质量具有重要临床价值[3,4]。miRNA与肿瘤的发生发展、凋亡也有着密切的联系，miR-542-3p通过各种多功能蛋白、生长因子信号、受体分子等参与细胞内周期进程的调控，并对细胞 DNA 的复制起始和增殖起到十分重要的作用[5]。miR-542-3p可通过抑制蛋白激酶 B信号通路进而抑制肿瘤内皮细胞增殖和集落形成。miR-203对免疫系统调控、血管生成和肿瘤转移等方面发挥重要作用[6]。研究证实，miR-203基因突变时，表达降低时，肿瘤细胞无限制増殖、血管生成速度加快，且相关细胞因子如VEGF、P53等均表达增高[6]。因此本研究探讨结直肠癌患者血清miR-542-3p和miR-203水平与临床病理特征的相关性，为结直肠癌患者的早期诊断、治疗提供理论及实践依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年8月至2018年9月在右江民族医学院附属医院胃肠外科行手术切除并经病理证实的结直肠癌患者134例为观察组，其中男82例，女52例；年龄47～68岁，平均年龄(57.5±10.8)岁；病程6个月～11年，平均病程(5.36±2.14)年。符合美国国家综合癌症网(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《NCCN CRC诊治指南》中的诊断标准[7]，手术切除标本后行病理检查以判定肿瘤最大径、肿瘤数目、病理学分级、TNM分期、有无淋巴血管间隙浸润、有无淋巴结转移。选择同期正常体检者118例为对照组，其中男71例，女47例；年龄46～69岁，平均年龄(57.1±11.2)岁。结直肠癌患者及正常体检者自愿提供血清，用作分析血清miR-542-3p和miR-203表达水平。2组在性别比、年龄、等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院附属医院伦理委员会审批。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①肠镜下见肿瘤形态为溃疡型或隆起型，病理结果为中、低、未分化腺癌或黏液腺癌；②所有研究对象签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①正在接受放化疗治疗的结直肠癌患者或患其他恶性肿瘤患者；②肝、肾、心功能异常者。

1.3 仪器与试剂 Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒(碧云天生物技术公司产品)，miR-542-3p和miR-203mRNA的表达测定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(宝生物工程大连有限公司)，实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)，NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)，超净工作台(上海恒跃医疗器械有限公司)，贝克曼库尔特ACCESS2化学发光免疫分析仪及配套癌胚抗原定量测定试剂盒。

1.4 miR-542-3p和miR-203水平测定 结直肠癌患者于根治术前及术后3～4周采集全血，健康体检者体检时采血，2组皆清晨空腹肱静脉抽血，置于10 ml无菌采血管中，室温静置30 min,4 500 r/min，离心10 min，分离血清，-70℃冻存备用，测定miR-542-3p和miR-203 mRNA 浓度和纯度，实时荧光定量 PCR仪检测其表达量。见表1、2。

表1 miR-542-3p、miR-203引物序列

表2 RT-PCR反应体系

1.5 血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)水平的测定 采用化学发光法检测定结直肠癌患者及健康体检者血清中CEA表达量。

2 结果

2.1 对照组和观察组术前血清miR-542-3p、miR-203、CEA水平表达 观察组术前miR-542-3p、miR-203水平低于对照组，CEA水平高于对照组(t值分别为26.682、15.932、31.136，P<0.05)。见表3。

组别miR-542-3p mRNAmiR-203mRNACEA(ng/ml)对照组(n=118) 3.48±0.153.15±0.172.54±0.56观察组术前(n=134)1.78±0.72∗1.95±0.86∗12.78±3.76∗

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 观察组术前、术后血清miR-542-3p、miR-203、CEA水平表达 观察组术后miR-542-3p、miR-203水平高于术前，CEA水平低于术前(t值分别为14.023、9.372、23.049，P<0.05)。见表4。

时间miR-542-3p mRNAmiR-203mRNACEA(ng/ml)术前1.78±0.721.95±0.8612.78±3.76术后2.98±0.68∗2.89±0.78∗4.77±1.43∗

注：与术前比较，*P<0.05

2.3 不同临床特征中血清miR-542-3p、miR-203水平比较 不同年龄、肿瘤最大径、肿瘤数目特征组中血清miR-542-3p、miR-203水平差异无统计学意义(t值分别为0.138、1.200、0.068、0.172、0.069、0.055，P>0.05)；而病理学分级越高、TNM分期越高、有淋巴血管间隙浸、有淋巴结转移、有复发，血清miR-542-3p、miR-203表达水平越低(t值分别为15.826、10.333、12.068、9.953、8.237、8.840、8.070、12.065、5.250、13.222，P<0.05)。见表5。

项目miR-542-3p t值P值miR-203 mRNAt值P值年龄(岁) <50(n=34)1.74±0.750.138>0.051.97±0.880.172>0.05 ≥50(n=100)1.76±0.721.94±0.83肿瘤最大径(cm) ≥5(n=84)1.82±0.711.200>0.052.00±0.800.069>0.05 <5(n=50)1.79±0.782.01±0.82肿瘤数目 单发(n=45)1.75±0.830.068>0.051.89±0.990.055>0.05 多发(n=89)1.72±0.731.90±0.98病理学分级 低、中分化(n=85)2.20±0.3115.826<0.052.54±0.268.840<0.05 高分化(n=49)1.32±0.311.67±0.66TNM分期 Ⅰ～Ⅱ(n=70)2.30±0.2110.333<0.052.63±0.208.070<0.05 Ⅲ～Ⅳ(n=64)1.58±0.521.81±0.79淋巴血管间隙浸润 无(n=52)2.17±0.3312.068<0.052.39±0.4112.065<0.05 有(n=82)1.40±0.401.47±0.46淋巴结转移 无(n=90)2.40±0.129.953<0.052.08±0.735.250<0.05 有(n=44)1.58±0.541.52±0.49复发 无(n=72)1.98±0.528.237<0.052.37±0.4213.222<0.05 有(n=62)1.38±0.311.41±0.42

2.4 CEA与miR-542-3p、miR-203相关性分析 CEA与miR-542-3p、miR-203呈负相关(r=-0.569、-0.613，P<0.05)。见表6。

表6 CEA与miR-542-3p、miR-203相关性分析

2.5 ROC曲线及灵敏度、特异度分析 受试者工作特征曲线提示，CEA、miR-542-3p、miR-203ROC曲线下面积(AUC)分别为0.753(95%CI 0.602～0.798)，0.680(95%CI 0.523～0.745)，0.658(95%CI 0.569～0.779)，miR-542-3p、miR-203两者的AUC相近，皆低于CEA，miR-542-3p、miR-203诊断结直肠癌的灵敏度、特异度相近(χ2=2.142、1.978，P>0.05)，皆低于CEA(χ2=8.986、10.541，P<0.05)。见表7，图1。

表7 ROC曲线及灵敏度、特异度分析

3 讨论

我国结直肠癌发病率逐年递增，好发于30～60岁的成人，发病率为7.8%，在恶性肿瘤排名第四位，1994至2002年，结直肠癌发病率的增长率为7.9%[8]。在世界范围内，结直肠癌成为危害人类健康排名第三的肿瘤，略低于肺癌，2014年，全球结直肠癌患者占所有恶性肿瘤15%，2015年高达27%，其病死率为25.03/10万，占恶性肿瘤死亡病例的14.56%，2012年全球结直肠癌新发病例超过200万，标化发病率为37.68/10万，标化死亡率为15.54/10万[9]。

miR-542-3p在肿瘤的发生发展中也扮演者重要的角色。研究表明，miR-542-3p对抑制细胞增殖发挥重要作用，并能强烈促进细胞凋亡，高度表达miR-542-3p的乳腺癌细胞株增殖能力低于高于野生株。低表达miR-542-3p蛋白的肿瘤细胞黏附内皮细胞的能力强，而肿瘤细胞与内皮细胞紧密结，才能穿过细胞外基质层,建立转移灶[10,11]。本研究中，观察组miR-542-3p水平低于对照组，且术后观察组miR-542-3p水平高于术前观察组，与CEA负相关，这与上述结论一致。miR-542-3p在人胚胎组织中广泛表达，在正常的甲状腺表达正常，甲状腺癌患者miR-542-3p蛋白表达异常降低，而随着甲状腺癌患者TMN分期的进展，miR-542-3p表达逐渐降低，本研究中，病理学分级越高、TNM分期越高、有淋巴血管间隙浸、有淋巴结转移、有复发，血清miR-542-3p表达越低，也证实了这一点。此外研究发现miR-542-3p蛋白对于脑膜瘤的发生发展具有重要的调控作用，其具有时间、空间表达特异性，若药物激活miR-542-3p蛋白表达，肿瘤细胞的生长得到有效抑制，miR-542-3p可能成为肿瘤治疗的分子靶点[12]。

miR-203在Hedgehog信号通路扮演着核心调节作用，配体(Shh)未与跨膜蛋白受体(Ptch)结合时，Ptch抑制跨膜蛋白受体(Smo)的活化，Smo被释放，其下游细胞因子miR-203被活化，促进miR-203移位到细胞核内，进而抑制下游原癌基因[13]。本研究结果显示，观察组miR-203水平低于对照组，且术后观察组miR-203水平高于术前观察组，与CEA呈负相关，与上述结论一致。miR-203具有强烈的抑制血管生成作用，进而抑制癌细胞增殖和迁移：肿瘤细胞中一些血管活性因子(MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-8)与miR-203表达负相关。此外本研究发现，病理学分级越高、TNM分期越高、有淋巴血管间隙浸、有淋巴结转移、有复发，血清miR-203表达越低，说明miR-203具有抑制癌细胞分化与侵袭迁移能力的作用，结合近期研究，IL-8、血管内皮生长因子(VEGF)由可能由miR-203调控，低表达miR-203的肿瘤细胞可促进IL-8、血管及VEGF的分泌，而VEGF、IL-8在供应肿瘤生长的血管系统的形成及实体肿瘤的发展过程中发挥重要作用[14,15]。本研究同时也发现，miR-542-3p、miR-203在诊断结直肠癌的灵敏度、特异度相近，miR-542-3p、miR-203具有较高的灵敏度、特异度，可作为诊断结直肠癌的生物学标志物，值得在临床上推广应用。

综上所述，miR-542-3p、miR-203在结直肠癌患者血清的表达量降低，miR-542-3p、miR-203在结直肠癌的发生发展过程中起抑制作用；miR-542-3p、miR-203具有较高的灵敏度、特异度，可作为诊断结直肠癌的生物学标志物，值得在临床上推广应用。