钟楚楚，赵晋彤，范 宇，刘浩真

(哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076)

夏枯草(PrunellaVulgarisL.)为药食同源的多年生草本植物，可清肝散火、明目、消结散肿[1-2]。现代药理学研究表明，其具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种药理学活性[3]。夏枯草的主要活性成分之一是黄酮类化合物[4]，其具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、调节免疫及心血管保护等药理作用[5-6]。鉴于总黄酮良好的药理活性，本文对醇浸渍提取法、醇溶剂回流提取法、超声辅助醇提取法提取夏枯草总黄酮，对夏枯草总黄酮的提取率进行比较，以期找到最佳提取方法，并通过单因素和正交实验法对超声辅助醇提取法的工艺条件进行优化。该研究将为夏枯草总黄酮的提取及开发利用提供了理论依据。

1 实 验

1.1 仪器设备与试剂

夏枯草，哈尔滨信衡中药材有限公司。

数显恒温水浴锅，上海力辰邦西仪器科技有限公司；数控超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；循环水多用真空泵，邦西仪器科技(上海)有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

实验所用试剂：芦丁标准品，上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯，无锡市亚泰联合化工有限公司。

1.2 标准曲线的绘制及样品总黄酮含量测定

精密量取芦丁标准品10 mg，用65%乙醇定容至100 mL容量瓶中，摇匀，备用。分别精确吸取0，1.0，2.0，4.0，6.0和8.0 mL芦丁标准溶液，依次放入1至6号25 mL容量瓶中，而后加入0.8 mL 5% NaNO2溶液，摇匀后放置6 min，加入0.8 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀后放置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，用65%乙醇定容至刻度，放置15 min后于510 nm处测定其吸光度[7]。以芦丁标准溶液的质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：A=8.343C+0.0122，R=0.9999。

吸取夏枯草提取液及供试品溶液适量，置于25 mL容量瓶中，按上述显色方法显色，于510 nm处测定其吸光度，并计算夏枯草总黄酮的提取率。

计算公式如下：

式中：C为计算出的夏枯草总黄酮的质量浓度，mg/mL；V为提取溶液体积，mL；n为提取溶液稀释倍数；m为所用夏枯草的质量，g。

1.3 提取方法的确定

1.3.1 醇浸渍提取法

称取夏枯草2.0 g，加入40 mL 65%乙醇，室温下浸渍2 h，过滤。共提取2次后，合并滤液，定容至100 mL，备用。

1.3.2 醇溶剂回流提取法

称取夏枯草2.0 g，加入40 mL 65%乙醇，水浴回流1.5 h，过滤。共提取2次后，合并滤液，定容至100 mL，备用。

1.3.3 超声辅助醇提取法

称取夏枯草2.0 g，加入40 mL 65%乙醇，超声提取40 min，过滤。共提取2次后，合并滤液，定容至100 mL，备用。

1.4 超声辅助醇提取法提取夏枯草总黄酮工艺条件的确定

1.4.1 单因素实验

称取夏枯草2.0 g，分别设定不同的乙醇体积分数(35%、45%、55%、65%、75%)，不同的提取时间(10、20、40、60、80 min)，不同的料液比(g/mL)(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)进行单因素实验，分别考察上述因素对夏枯草总黄酮提取率的影响。

1.4.2 正交实验

在1.4.1节单因素实验的基础上，以总黄酮提取率为考察指标，选取乙醇体积分数(45%、55%、65%)、提取时间(20、40、60 min)、料液比(g/mL)(1:20、1:25、1:30)作为考察因素，进行L9(34)正交实验，以确定夏枯草总黄酮的最佳提取工艺，正交实验因素水平如表1所示。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal design

2 结果与讨论

2.1 提取方法的确定

在提取溶剂同为65%乙醇，料液比均为1:20的前提下，3种提取方法醇浸渍提取法、醇溶剂回流提取法、超声辅助醇提取法对夏枯草总黄酮的提取率分别为4.22%、5.34%、5.96%。结果表明超声辅助醇提取法对夏枯草总黄酮的提取率最高，因此继续对该提取方法进行单因素及正交实验优化工艺条件。

2.2 单因素实验中各因素对夏枯草总黄酮提取率的影响

2.2.1 乙醇体积分数对提取率的影响

当乙醇体积分数在35%～55%范围内时，夏枯草总黄酮提取率随着乙醇体积分数的升高而增加，当乙醇体积分数为55%时，提取率达到最高为5.83%，乙醇体积分数继续提高，夏枯草总黄酮提取率反而开始逐渐下降。分析其原因可能因为乙醇浓度过高会溶出较多的脂溶性杂质及亲脂性强的成分，其与总黄酮竞争乙醇溶剂，间接地减少了总黄酮的溶出量，使得提取率下降。因此选取最优乙醇体积分数为55%。

图1 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate

2.2.2 提取时间对提取率的影响

当提取时间由20 min增加到40 min时，夏枯草总黄酮提取率由4.19%提高到最大值5.46%，之后随提取时间的延长，提取率逐渐下降。分析其原因可能因为提取时间过长，导致部分黄酮类化合物结构被破坏，进而使夏枯草总黄酮的提取率下降。因此选取最优提取时间为40 min。

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate

2.2.3 料液比对提取率的影响

在料液比为1:10～1:25范围内，提取率随着料液比的增大而提高，当料液比为1:25时提取率达到最高值，而后随着溶剂体积的增加，提取率下降。因此选取最优料液比为1:25。

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Effect of ratio of Solid-liquid ratio on extraction rate

2.3 正交实验

根据表2实验数据可知，影响夏枯草总黄酮提取率的因素依次为料液比>乙醇体积分数>提取时间，最佳提取工艺条件组合为A3B1C1，即乙醇体积分数为65%、提取时间为20 min、料液比为1:20，在此条件下夏枯草总黄酮的提取率为7.01%

表2 正交实验结果直观分析Table 2 The experimental results of orthogonal experiment

3 结 论

本实验综合比较了醇浸渍提取法、醇溶剂回流提取法、超声辅助醇提取法对夏枯草总黄酮提取率的影响，结果表明超声辅助醇提取法对夏枯草总黄酮的提取率最高，并通过单因素实验及正交实验优选出该提取法的最佳工艺条件:乙醇体积分数为65%、提取时间为20 min、料液比为1:20，在此条件下，夏枯草总黄酮提取率为7.01%，本研究为夏枯草总黄酮的提取及开发利用提供了理论依据。