金剑英 朱延安 谢静静 金丹

人类1/3的癌症与RAS基因突变有关[1]。v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（K-RAS）蛋白是RAS家族中的一员，可调控分子信号通路，从而影响细胞分化和增殖[2]。K-RAS易发生基因突变，是人类肿瘤常见的致病原因。在所有肿瘤中，K-RAS基因突变发生率约为20%，常见于胰腺癌、结直肠癌（CRC）、肺癌等恶性实体肿瘤。在世界范围内，CRC患病率呈不断增长趋势[3]。对CRC患者采取放化疗或手术切除等治疗后，复发率仍较高[4]。这是因为CRC患者发生K-RAS基因突变后，易产生耐药，常规治疗手段难以奏效。有研究表明，K-RAS基因突变是CRC发生、发展及耐药的主要驱动基因之一[5]。在CRC患者中，K-RAS基因突变发生率为20%～50%，最常见突变为G12D、G12V和G13D。根据肿瘤细胞耐药机制激活的途径来克服肿瘤耐药，是当前肿瘤治疗的研究热点[6-7]。有研究表明，丝裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）抑制剂曲美替尼（Trametinib）对RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（BRAF）变异的黑色素瘤具有良好的治疗效果[8]。2015年美国食品药品管理局正式批准Trametinib联合BRAF抑制剂维罗非尼（Vemurafenib）治疗BRAF变异的黑色素瘤[9]。亦有文献报道，MEK抑制剂考比替尼（Cobimetinib）通过肿瘤细胞RAS/Raf/MEK/ERK信号通路有选择地使MEK激酶失活，从而阻断RAS/Raf通路信号转导，诱导PKC和PI3K通路激活，进而诱导p53上调的凋亡调节物（PUMA）介导的细胞凋亡，能有效治疗CRC[10]。本研究对MEK抑制剂Trametinib在K-RAS基因突变的CRC细胞中的耐药机制作一探讨，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞与试剂 K-RAS基因突变型CRC细胞株LS174T（G12D）、DLD-1（G13D）、HCT116（G13D）均购自上海细胞库。MEK抑制剂Trametinib（M8697-10UG）、JAK2/STAT3 抑制剂鲁索替尼（Ruxolitinib，SAB4300123）或LY5（GW21465）均购自美国Sigma-Aldrich公司，临用前使用RPMI1640培养液稀释到终浓度。RPMI1640培养基（61870044）、胎牛血清（FBS，12662011）均购自美国 Gibco BRL 公司；p-STAT3（Y70562214）、STAT3（KHO0481）、p-ERK1/2（KHO058）、GAPDH 抗 体（EPR16891）均购自美国Cell Signaling公司。DMSO（DZ0231）购自AMRESCO公司。

1.2 细胞培养及传代 将LS174T、DLD-1、HCT116细胞株置于含10%FBS的RPMI 1640培养液中，在5%CO2、37℃的培养箱中培养，每2～3d传一代。

1.3 Trametinib对K-RAS基因突变的CRC细胞中STAT3的激活作用检测 采用Western blot法。用Trametinib（1、5、10μM 浓度）处理 LS174T、DLD-1、HCT116细胞，检测其STAT3上游蛋白JAK2、JAK3、Src等是否激活。预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞3遍，蛋白裂解液提取细胞核和细胞质蛋白；然后进行蛋白浓度测定，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质样品，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，电泳。免疫反应：封闭，孵育一抗，洗涤，孵育二抗，洗涤；应用化学发光成像系统对信号进行评价。实验重复3次。

1.4 HCT116细胞 p-STAT3Y705、STAT3和 p-ERK1/2表达检测 采用Western blot法。分别用Trametinib（5μM）、Ruxolitinib（2.5μM）/LY5（1μM）或 Trametinib（5μM）+Ruxolitinib（2.5μM）/LY5（1μM）处理 HCT116 细胞 24h，检测其p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表达。实验步骤同1.3，重复3次。

1.5 HCT116细胞增殖能力检测 采用磺酰罗丹明B蛋白染色实验。分别用 Trametinib（5μM）、LY5（1μM）或Trametinib（5μM）+LY5（1μM）处理 HCT116 细胞 24h，去上清液，按细胞密度1 000个/孔接种于60mm孔盘中，再用新鲜的培养基培养2周。10%冷的三氯乙酸固定细胞，4℃放置1h，反复用蒸馏水洗，待自然干燥。每孔加入冰醋酸配制的磺酰罗丹明B溶液100μl，室温下染色15min，流水缓慢洗去染液，空气下自然干燥。在100倍显微镜下观察。以DMSO为参照，计算细胞增殖率。实验重复3次。

1.6 HCT116、DLD-1细胞迁移能力检测 采用细胞迁移划痕实验。先用记号笔在6孔板上均匀地划横线，然后按细胞密度1×105个/孔（预实验中设不同的细胞浓度）分别接种HCT116、DLD-1细胞。划痕后分别用Trametinib（1μM）、LY5（1μM）或 Trametinib（1μM）+LY5（1μM）处理细胞 60h，放入 37℃、5%CO2培养箱培养，取样，在显微镜下拍照，观察细胞迁移情况。以DMSO为参照，计算细胞迁移率。实验重复3次。

1.7 HCT116、DLD-1细胞生存率检测 采用MTT实验。分别用 Trametinib（1 或 5μM）、LY5（0.5 或 1μM）、Trametinib（1或5μM）+LY5（0.5或 1μM）处理 HCT-116、DLD-1细胞；无药物处理、常规培养的HCT-116、DLD-1细胞作为阴性对照。在37°C、5%CO2的条件下分别培养48、72h，将96孔板置于离心机1 500r/min离心5min，除去培养基，加入MTT溶液25μl（5mg/ml）。然后在37°C条件下孕育4h，将微滴板置于离心机1 500r/min离心5min，除去含MTT溶液的培养基，加入DMSO溶解晶体（10μg/孔），振荡 10min。在 492nm 处用 Bio-Rad M450酶标仪测量各孔吸光度（OD），取3孔OD值的均数计算细胞生存率。生存率=OD实验组/OD对照组×100%。实验重复3次。

1.8 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Trametinib对K-RAS基因突变的CRC细胞中STAT3的激活作用 在HCT116、LS174T和DLD-1细胞中，Trametinib可明显抑制ERK1/2的磷酸化，同时诱导p－STAT3Y705增加，见图1。同时发现Trametinib诱导STAT3上游激酶p-JAK2高表达。初步提示激活JAK2/STAT3信号通路可促进CRC肿瘤生长，同时引起对MEK抑制剂的反馈性耐药。

图1 不同浓度Trametinib激活K-RAS基因突变的CRC细胞后STAT3表达的电泳图（T1为1μM浓度的Trametinib；T5为5μM浓度的Trametinib；T10为10μM浓度的Trametinib）

2.2 联合用药对HCT116细胞p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表达的影响 在HCT116细胞中，Trametinib+Ruxolitinib/LY5可同时阻断 p-STAT3Y705、p-ERK1/2的激活，见图2；提示可能发挥协同抑制肿瘤细胞生长的作用。

图2 联合用药后HCT116细胞p-STAT3Y705、STAT3和p-ERK1/2表达的电泳图（R2.5为2.5μM浓度的Ruxolitinib；T5为5μM浓度的 Trametinib；L1为1μM浓度的LY5）

2.3 联合用药对HCT116细胞增殖能力的影响 Trametinib、LY5、Trametinib+LY5 组 细 胞 增 殖 率 分 别 为62.11%、31.30%和9.95%，差异有统计学意义（P＜0.05），其中Trametinib+LY5组明显低于单药组（均P＜0.05），见图3。

2.4 联合用药对HCT116、DLD-1细胞迁移能力的影响在 HCT116 细胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5 组细胞迁移率分别为69.8%、52.8%、7.2%，差异有统计学意义（P＜0.05）；在 DLD-1 细胞中，Trametinib、LY5、Trametinib+LY5组细胞迁移率分别为66.0%、62.0%、4.0%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图3 联合用药对HCT116细胞增殖能力的影响

图4 联合用药对HCT116、DLD-1细胞迁移能力的影响（显微镜下，×100）

2.5 联合用药对HCT116、DLD-1细胞生存率的影响 在 HCT116、DLD-1细胞中，Trametinib+LY5组细胞生存率明显低于单药组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 1～2。

表1 不同剂量Trametinib和LY5处理HCT-116细胞72h后细胞生存率（%）

表2 不同剂量Trametinib和LY5作用于DLD-1细胞48h后细胞生存率（%）

3 讨论

到目前为止，化疗和靶向药物治疗是晚期CRC的主要治疗方法。靶向治疗CRC的EGFR单克隆抗体主要为帕尼单抗、西妥昔单抗，与内源性配体竞争性抑制EGFR转导，从而发挥抗肿瘤作用。有研究证明EGFR单克隆抗体对K-RAS基因突变型CRC患者无效[11]。K-RAS蛋白属于EGFR信号通路下游的小分子G蛋白，KRAS基因发生突变会引起该信号通路异常活化，从而使EGFR单克隆抗体和EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗无效。所以，针对K-RAS突变体的药物研究具有广阔的前景，将为EGFR抑制剂耐药患者带来更好的治疗效果。

K-RAS抑制剂作用于RAS/Raf/MEK/ERK细胞信号传导通路上游基因，其成功开发进一步促进了对KRAS基因突变的CRC治疗研究。30多年来，科学家们认识到RAS编码蛋白的基因突变是最强大的癌症驱动因素之一[11-12]。可是，经过几十年的研究，仍未开发出一种能够安全阻止RAS蛋白活性的药物。K-RAS被认为是科学界最重要的癌基因，广泛认为无药物可以使用[13]。由于K-RAS基因突变靶向方向研究无果，人们开始转于靶向K-RAS的下游信号通路的研究。K-RAS通过下游效应途径（如MEK/ERK、STAT3和PI3K/AKT等途径）进行信号传递[14]。在K-RAS基因突变的肿瘤细胞中，MAPK信号在肿瘤发生和发展中的作用比PI3K更重要。药物开发的重点是经典的RAS激活的MAPK通路，MEK 1/2在MAPK信号通路促进肿瘤产生、增殖和凋亡过程中起着关键作用[10]。Trametinib已被美国食品药品管理局批准用于治疗转移性黑色素瘤[15-17]。Trametinib可作为晚期CRC切除和转移的一线辅助治疗手段，或者结合化疗药物使用。在未来10年，其他MEK抑制剂有望被批准作为晚期CRC的一线治疗药物。

鉴于MEK抑制剂Trametinib在临床治疗转移性黑色素瘤和不能手术治疗的黑色素瘤患者的优势，科学家提出采用K-RAS下游MEK抑制剂治疗K-RAS基因突变等EGFR抑制剂耐药的CRC患者[18]。本研究发现，虽然MEK抑制剂可以减缓K-RAS基因突变的CRC细胞生长，但不能杀死癌细胞，它们最终能通过一条备用信号通路继续生存并保持旺盛生长。MEK抑制剂Trametinib在CRC中可以诱导STAT3磷酸化/激活。MEK抑制剂与STAT3抑制剂联合使用，可明显抑制癌细胞生长。本研究结果提示，MEK抑制剂和STAT3抑制剂联用治疗CRC的效果明显优于单用MEK抑制剂或STAT3抑制剂。

综上所述，笔者初步发现在K-RAS基因突变的CRC中，MEK抑制剂可明显抑制肿瘤细胞克隆形成，减弱肿瘤细胞增殖能力和迁移能力，其机制可能与抑制ERK1/2的磷酸化、诱导p-STAT3Y705增加和STAT3上游激酶p-JAK2高表达、激活STAT3信号通路有关，但是两者具体机制仍需要进一步研究明确。