张伟华 秦艳青 沈金杰

原发性肝癌是发展中国家癌症死亡的第二大原因，也是发达国家男性癌症死亡的第六大原因[1-2]。由于多发肿瘤、转移、肝功能损害等，外科手术治疗适用于不到20%的原发性肝癌患者[3]。不可逆电穿孔(IRE)在临床上得到了越来越多的应用[4]。IRE联合同种异体NK细胞免疫治疗已被应用于胰腺癌的治疗[5]。故我们推测IRE联合同种NK细胞免疫治疗可能是一种有前途的PLC联合治疗方法。现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2017年1月至2019年8月于本医院诊治的原发性肝癌患者 80例为研究对象，所有患者经影像学检查符合原发性肝癌的相关诊断标准，患者凝血功能均正常，且对研究知情同意。排除患有器质性疾病和精神性疾病者。研究经医院伦理委员会批准。

二、研究方法

将患者分为两组，分别为IRE组和IRE-NK组。所有经皮消融均由计算机断层扫描和超声引导。根据IRE术前计划，确定探头数量、插针方法和手术参数。电极之间的距离为1.5～2.5 cm[6]，有效曝光探头距离为1.5～2.5 cm。IRE发生器的参数设置如下：脉冲长度为70～90 μs，脉冲重复频率为70～90，平均场强为800～2 200 V/cm。如果目标病灶区域直径为>2 cm，则执行一次或多次。所有脉冲均在心室不应期发出，以避免心律失常的发生。消融后进行CT检查，确定肿瘤边缘消融范围大于0.5～1 cm，然后将患者转入重症监护室24 h，生命体征稳定后转入普通病房。如有并发症，给予相应治疗。

IRE-NK组患者的外周血在IRE治疗前1～4 d进行采集，以获得NK细胞[21]。利用人高活性NK细胞体外制备试剂盒制备出数量多、纯度高、活性高的NK细胞，即高活性NK细胞。NK细胞免疫治疗在采血后14 d内开始，连续3 d(IRE后8～12 d)。下一个疗程开始于上一个疗程最后一次输液前1天。IRE-NK组患者接受4个疗程的NK细胞免疫治疗。

三、观察指标

记录患者的所有不良事件;评估肿瘤生物标志物[AFP，循环肿瘤细胞(CTCs)]、淋巴细胞数量和功能、临床反应、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的变化。治疗前后记录KPS评分，作为生活质量指标。

四、统计学分析

结 果

一、患者的一般资料

80例患者中男性 53 例，女性 27 例，年龄 40～72 岁，平均(55.3 ± 5.1)岁。肝功能Child-Pugh分级：A级49 例[平均(5.7 ± 0.3)分]，B 级 31 例 [平均(7.3 ± 0.3)分]。采用随机数值表法将患者分为 对照组和观察组，每组 40 例。

二、两组免疫功能及KPS评分比较

IRE组和IRE-NK组在治疗1个月之后进行免疫功能检测，观察免疫细胞的数量。其中IRE-NK组总T细胞数量(1730±198)、CD4+T细胞(925±98)、CD8+T细胞(805±88)、NK细胞(754±84)均明显多于IRE组[1 422±220、801±83、621±54、500±72]，两组间有差异有统计学意义(t=1.802,P=0.146;t=1.672,P=0.016;t=1.946,P=0.012;t=3.977,P=0.017)；IRE组和IRE-NK组治疗前KPS分别为(64.14±15.6)和(65.96±17.8)(t=0.133，P=0.900)，治疗后1个月KPS分别为74.13±11.2和82.21±13.2。两组治疗后KPS均较治疗前明显改善[(t=3.290,P=0.002)；(t=4.638,P=0.000)]。治疗后1个月，IRE-NK组的KPS显著升高。

三、两组无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)及肿瘤标记物变化比较

IRE患者中位PFS为(10.6±2.7)个月，短于IRE联合同种NK细胞免疫治疗(15.5±3.8)个月。两组间PFS差异有显著性(t=1.821，P=0.018)。IRE组和IRE-NK组一年OS分别为(66.7±9.3)%和(77.8±12.3)%。两组间OS差异有统计学意义(t=1.247，P=0.028)；两组治疗后1个月AFP[(182±54) vs (54±13)]IU/mL和TCTs[(8±6)比(5±4)]表达均较治疗前AFP[(220±115)比(202±107)]IU/mL、TCTs[( 13±5)比(12±4)]降低(t=3.992，P=0.016；t=4.163，P=0.043)。两组治疗前的生物标志物比较，差异无统计学意义(t=0.199，P=0.189；t=0.271，P=0.083)。然而，治疗1个月后，IRE-NK中TCTs的表达显著降低(P<0.05)。

四、安全性评价

治疗后的不良反应包括疼痛、胸腔积液、腹水、疲劳和发热。IRE组有6例、1例、3例、3例和10例出现上述症状。在IRE-NK组中，分别有4、4、4、5和11名患者出现这些症状。所有不良反应主要发生在IRE后2周内，少数患者NK细胞免疫治疗后出现发热。

讨 论

作为一种非热消融和微创治疗方法，IRE为不能切除的PLC带来了治疗前景[7],其具有全消融率高，无复发期长，不受血流吸收影响，是一种强有力的临床工具[8]。KIR可识别细胞表面的主要组织相容性复合物I类(MHC-I)分子，两种分子结合后，NK的活化受到抑制[9-10]。人们普遍认为KIR/HLA不匹配的NK细胞在恶性肿瘤治疗中更有效，且不会引起移植物抗宿主反应[11]。

在本研究中，Th1细胞因子增加，表明IRE联合NK细胞免疫治疗可能改变Th1/Th2的平衡并激活细胞免疫。IRE-NK组Th2细胞因子无变化，但IRE组IL-6明显高于治疗前。我们推测其可能与损伤相关分子模式(DAMP)介导的免疫激活有关。线粒体DNA，高迁移基团盒-1(HMGB-1)、热休克蛋白和s100蛋白可通过某种方式从坏死细胞中释放。然后刺激相应的TLR产生包括IL-6在内的细胞因子。Bulvik等[12]报道了雌性C57BL/6小鼠肝切除后6 h IL-6的峰值水平是rf6h的3倍。他们的研究表明，IRE不仅能保护大血管，还能保护微循环，增强包括IL-6在内的细胞因子进入全身循环的能力。众所周知，IL-6具有潜在的致瘤能力，与肝癌的进展呈正相关，对机体免疫功能有负调节作用[13]。本研究观察到IRE-NK组IL-6水平无明显升高，说明NK细胞免疫治疗可以调节和改善细胞免疫应答，积极调节免疫系统功能，提高抗肿瘤作用。但是，其作用的具体机制有待进一步研究。

总之，这项单中心前瞻性研究证明了IRE联合同种异体NK细胞免疫治疗不能切除的PLC的短期安全性和有效性。然而，本研究存在样本量小、随访时间短的局限性，因此其长期疗效应通过延长患者组和延长随访期来评估。