李 莹，曹 森，刘志刚，赵治兵，田 驰，王 瑞*

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005； 2.贵阳市花溪区市场监督管理局，贵州 贵阳 550025）

天麻为兰科植物天麻Gastrodia elataBl.的干燥块茎，又名赤箭、独摇芝、离母，主产于贵州、云南、四川、陕西等地，是我国名贵中药材之一，其味甘、性平，具有息风止痉、镇静安眠、祛风通络之功效，用于治疗小儿惊风、癫痫抽搐、头痛眩晕等病症［1-2］，同时有着神经保护功能，在增强智力、防治老年痴呆等方面有一定效果［3-5］。它主要含天麻苷类及其酚类、有机酸类、甾醇类、多糖类化合物，其中天麻素（天麻苷）、对羟基苯甲醇（天麻苷元）、对羟基苯甲醛等酚类成分是其主要活性物质，另外现有研究表明，腺苷、天麻素药效作用相似，也可将两者视为该类成分［6-7］。天麻干品质地硬，药用和食用相对困难，而且与鲜品相比既降低了营养成分，又改变了气味及口感［8］，近年来以鲜品为原料生产加工的保健品和药膳逐渐受到关注，但目前相关活性成分的研究主要是针对经过炮制处理后的干天麻，鲜有涉及鲜天麻［9］。因此，本实验采用HPLC 法同时测定鲜天麻中腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛的含有量，以期为客观全面评价其质量提供科学依据。

1 材料

LC-15C 型高效液相色谱仪、AUW120D 型电子分析天平（日本岛津公司）；KQ-5200DB 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。腺苷（批号20160523）、天麻素（批号20161217）、对羟基苯甲醇（批号20160317）、对羟基苯甲醛（批号20160415）对照品均购于上海金穗生物科技有限公司，质量分数均＞98.0%。天麻采自贵州省大方县乌蒙腾菌业有限公司实验基地，品种为乌天麻，经贵阳学院武孔云教授鉴定为兰科天麻属植物天麻Gastrodia elataBl.的新鲜块茎。乙腈、甲醇为色谱纯（美国Tedia 公司）；其他试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 含水量测定 鲜品清洗干净后切薄片（1～2 mm），平行3 份，烘干法［1］测得其平均含水量为82.09%，RSD为1.1%。

2.2 色谱条件 ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0～30 min，3%～5% A；30～35 min，5%～20% A；35～45 min，20%～50% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长270 nm；进样量20 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.3 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，10%甲醇制成每1 mL 分别含腺苷0.02 mg、天麻素0.2 mg、对羟基苯甲醇0.15 mg、对羟基苯甲醛0.02 mg 的溶液，即得。

2.4 供试品溶液制备 精密称取0.5 g 鲜品粉碎，加入一定量80%甲醇，转移至具塞锥形瓶中，再加入80%甲醇至20 mL，称定质量，超声（200 W、40 kHz）45 min 后放冷至室温，用80%甲醇补足减失的质量。精密量取5 mL 上清液于具塞试管中，加入10 mL 甲醇并振摇5 min，白色絮状沉淀产生完全后离心10 min（4 000 r／min），浓缩上清液，残渣用80%甲醇溶解后转移至5 mL 量瓶中，定容后摇匀，0.45 μm 微孔滤膜进行滤过，取续滤液，即得。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 将对照品溶液梯度稀释成系列质量浓度，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以峰面积（Y）对溶液质量浓度（X）进行线性回归，结果见表1，可知各成分在各自线性范围内呈良好的线性关系。

表1 各成分线性关系

2.5.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定6 次，测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛峰面积RSD 分别为0.6%、0.1%、1.1%、0.1%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取适量鲜品，按“2.4”项下方法制备供试品溶 液，室 温下于0、3、5、6、8、12、24 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛峰面积RSD 分别为1.4%、1.7%、0.2%、2.1%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批鲜品，按“2.4”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛含有量RSD 分别为0.4%、1.0%、0.4%、2.5%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 取含有量已知的鲜品9 份，每3份为1 组，加入适量对照品溶液，按“2.4”项下方法制成高、中、低3 个质量浓度的供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，结果见表2。

2.6 样品含有量测定 按“2.4”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表3。

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验比较了甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸、甲醇-0.1% 甲酸、甲醇-0.05% 磷酸、乙腈-0.05% 磷酸等，发现以乙腈-0.05%磷酸为流动相梯度洗脱时，出峰时间合适，色谱峰分离度好，理论塔板数以天麻素、对羟基苯甲醇计大于10 000，符合2015 版《中国药典》规定的大于5 000。然后，对腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛在200～400 nm 处进行波长扫描，发现四者最大吸收波长分别为260、270、270、280 nm，故选择270 nm 作为检测波长，此时各成分响应值较好。接着，考察了回流、超声提取，发现后者重复性明显更高，再比较超声30、45、60 min，发现30 min 时各成分含有量较低，而45、60 min时含有量较高且结果相近，考虑到效率方面，故选择45 min作为提取时间，同时超声提取后加入甲醇并离心时，可去除多糖类成分对有含量测定的干扰。同时，对温度也进行了考察，发现25 ℃时色谱峰分离度高于18 ℃，故选择在25 ℃下测定。

3.2 含有量分析 表3 显示，不同批次鲜天麻均含有腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛，以天麻素含有量最高，其次是对羟基苯甲醇、腺苷，对羟基苯甲醛最低，与干品一致［10-12］。由此可知，同一产地不同批次鲜天麻中相同成分含有量存在一定差异，故对其质量控制进行深入研究、建立合理的含有量测定方法非常重要。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝9）

表3 各成分含有量测定结果（n＝3）

4 结论

目前，关于天麻有效成分的研究主要集中于炮制品，但其炮制方法多样，对主要成分含有量的影响也较大［13-14］，以润制、蒸制为主［15］，其中硫磺熏蒸法由于操作简单、成本低廉、成品外观好而更为常用。但硫熏程度的差异会导致天麻质量严重不一，而且硫磺含砷量较高，易在加工过程中引入杂质，危害人类健康，故直接测定鲜天麻中有效成分含有量可避免炮制过程对其变化的影响，并能更客观准确地评价该药材质量。

2015 年版《中国药典》以天麻素、对羟基苯甲醇含有量总和为质量控制指标［16］，但现代药理研究表明，中药药效的发挥离不开多种活性成分的共同作用，故多种成分含有量同时测定才能满足中药质量评价的需求。本实验建立HPLC 法同时测定鲜天麻中腺苷、天麻素、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛的含有量，该方法灵敏度高，分离度好，可重复性强，可为全面客观地评价该药材质量提供参考。