石效荣，刘义升*，邢树礼，卢立明，李艳江，刘 焕，王 越，贾善学

（1.滨州医学院附属医院药学部，山东 滨州 256603； 2.滨州市食品药品检验检测中心，山东 滨州 256600）

天麻醒脑胶囊是由天麻、熟地黄、肉苁蓉、石菖蒲、地龙、远志6 味药材加工而成的中药制剂，具有滋补肝肾、平肝息风、通络止痛的功效，临床上主要用于记忆力减退、反应迟钝、失眠、头痛、头晕、耳鸣、腰酸等病症的治疗［1］，可明显增加大鼠脑血液流量，改善小鼠脑血液循环，具有抗脑缺血缺氧作用［2］，通过降低脑组织乙酰胆碱水平、减少自由基产生来改善血管性痴呆大鼠学习记忆功能障碍［3］，通过多种途径改善记忆损伤模型动物的学习记忆功能［4］，对后循环缺血性眩晕［5］、颈性眩晕［6］、慢性紧张型头痛［7］、椎基底动脉供血不足眩晕［8］、改善血管性认知功能障碍［9］等疾病临床效果显著。

2015 年版《中国药典》一部［1］仅以天麻素含有量为指标，对天麻醒脑胶囊进行质量控制，前期文献报道也仅涉及到该成分［10-11］，而该制剂成分复杂，具有多靶点、协同作用的特点，单一成分难以全面评价其内在质量。因此，本实验首次建立HPLC 法同时测定天麻醒脑胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-细辛醚、α-细辛醚的含有量，以期全面评价其质量。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BP-211D 型电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。天麻素（批号110807-201809，含纯度 96.7%）、β-细辛醚（批号112018-201802，含纯度99.3%）、松果菊苷（批号111670-201706，含纯度89.7%）、毛蕊花糖苷（批号111530-201713，含纯度92.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；巴利森苷E（批号PRF16011523，含纯度97.1%）、巴利森苷B（批号14122013，含纯度98.5%）、巴利森苷C（批号PRF7101341，含纯度98.4%）、巴利森苷A（批号14122302，含纯度98.4%）、α-细辛醚对照品（批号PRF8051843，含纯度99.2%）均购自成都普瑞法科技开发有限公司。天麻醒脑胶囊（0.4 g／粒，批号20181104、20181116、20181214）源自云南永孜堂制药有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯（德国Merck 公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相［乙腈-甲醇（1∶1）］（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱（0～13.0 min，11.0% A；13.0～32.0 min，11.0%～28.0% A；32.0～41.0 min，28.0%～ 45.0% A；41.0～56.0 min，45.0%～72.0% A；56.0～65.0 min，72.0%～11.0% A）；体积流量1.0 mL／min；柱温35 ℃；检测波长220 nm［1，10-12］（0～32.0 min，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A）、330 nm［13-15］（32.0～41.0 min，松果菊苷、毛蕊花糖苷）、257 nm［16］（41.0～65.0 min，β-细辛醚、α-细辛醚）；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-细辛醚、α-细辛醚对照品适量，50% 甲醇分别制成 0.426、0.538、0.132、0.298、0.914、0.576、0.212、1.478、0.652 mg／mL贮备液，各精密量取2.5 mL，置于同一50 mL 量瓶中，50%甲醇制备，即得（含21.3 μg／mL 天麻素、26.9 μg／mL 巴利森苷E、6.6 μg／mL 巴利森苷B、14.9 μg／mL 巴利森苷C、45.7 μg／mL 巴利森苷A、28.8 μg／mL 松果菊苷、10.6 μg／mL 毛蕊花糖苷、73.9 μg／mLβ-细辛醚、32.6 μg／mLα-细辛醚）。

2.2.2 供试品溶液 取胶囊适量，倾出内容物，混匀，取约0.2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，密塞，称定质量，回流提取45 min，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按2015 年版《中国药典》一部中胶囊处方工艺，分别制备缺天麻、肉苁蓉和熟地黄、石菖蒲的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性考察 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分与相邻色谱峰均能达到有效分离（分离度均大于1.5），理论塔板数均不低于4 500，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下贮备液各2.0 mL，置于20 mL 量瓶中，50% 甲醇稀释至刻度，摇匀，取适量用50%甲醇依次稀释2、5、10、15、20 倍，制成系列质量浓度对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-细辛醚、α-细辛醚峰面积RSD 分别为0.95%、1.03%、1.22%、0.87%、0.71%、1.16%、1.34%、0.59%、0.61%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批胶囊适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-细辛醚、α-细辛醚含有量RSD 分别为1.15%、1.47%、0.82%、1.26%、1.19、1.62%、1.35%、0.94%、1.03%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，于0、2、4、6、12、18 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-细辛醚、α-细辛醚峰面积RSD 分别为0.71%、0.66%、1.18%、1.31%、0.94%、1.13%、1.29%、0.63%、0.74%，表明溶液在18 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取含有量已知的同1 批胶囊适量，倾出内容物，混匀，精密称取9 份，每3份为1 组，每份约0.1 g，置于具塞锥形瓶中，按照2015 年版《中国药典》四部要求，使对照品加入量相当于样品量的50%、100%、150%，精密加入对照品溶 液（含 0.254 mg／mL 天麻素、0.322 mg／mL巴利森苷E、0.094 mg／mL 巴利森苷B、0.206 mg／mL 巴利森苷C、0.574 mg／mL 巴利森苷A、0.346 mg／mL 松果菊苷、0.156 mg／mL 毛蕊花糖苷、0.942 mg／mLβ-细辛醚、0.418 mg／mL α-细辛 醚）0.5、1.0、1.5 mL，各 3 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-细辛醚、α-细辛醚平均加样回收率分别为99.14%、98.86%、96.97%、99.40%、98.37%、97.89%、97.46%、100.00%、96.88%，RSD 分别为0.94%、1.03%、1.29%、0.88%、1.52%、1.27%、1.30%、0.81%、1.16%。

2.9 样品含有量测定 取3 批胶囊适量，倾出内容物，混匀，精密称取约0.2 g，按“2.2.2”项下方法平行制备3 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 讨论

3.1 指标成分确定 天麻醒脑胶囊中天麻功效息风止痉、平抑肝阳、祛风通络，为君药；地龙功效清热定惊、通络平喘，熟地黄、肉苁蓉功效滋阴补肾、填精补髓，石菖蒲、远志功效化痰开窍、醒神益智，诸药合奏，共达滋补肝肾、平肝息风、通络定眩之效。研究显示，天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 等天麻素类成分为天麻主要活性成分，松果菊苷、毛蕊花糖苷等苯乙醇苷类为肉苁蓉主要活性成分，毛蕊花糖苷为熟地黄中苯乙醇苷类代表性成分，β-细辛醚、α-细辛醚等挥发油为石菖蒲主要活性成分，故本实验选取上述9 种成分作为指标成分。

3.2 流动相筛选 本实验首先考察了流动相乙腈-0.1% 磷 酸［1，11-12］、甲 醇-0.1% 甲 酸［13-14，16-17］、乙腈-0.1% 甲酸［18］、乙腈-0.1% 冰醋酸［15］，发现以乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%冰醋酸为流动相时，基线不平稳，巴利森苷B 峰拖尾严重，巴利森苷B、巴利森苷C 分离度不符合要求；以乙腈-0.1%甲酸为流动相时，基线不平稳；以甲醇-0.1%甲酸为流动相时，天麻素达不到基线分离，故将乙腈和甲醇按1∶1 比例混合后，再与0.1%甲酸一起梯度洗脱，同时对两者比例不断摸索，最终确定为“2.1”项下条件。

3.3 供试品溶液提取方法筛选 本实验考察了提取溶剂（甲醇［10，15-16］、50%甲醇［13-14］、乙醇、稀乙醇［12］）、提取方式（超声提取［10-17］、加热回流提取）对天麻醒脑胶囊中各成分综合提取率、色谱峰峰形、检测时间的影响，同时比较了提取时间30、45、60 min。最终确定，供试品溶液提取方法为50%甲醇加热回流提取45 min。

4 结论

本实验建立了HPLC 法同时测定天麻醒脑胶囊中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、松果菊苷、毛蕊花糖苷、β-细辛醚、α-细辛醚的含有量，该方法简便准确，专属性强，可为该制剂质量控制和综合评价提供参考依据。