HPLC 法同时测定小儿泄泻停颗粒中9 种成分

2020-02-18胡巍巍刘晨旭

中成药 2020年1期

胡巍巍，王茜，韩雪，刘晨旭

（1.石家庄医学高等专科学校，河北石家庄 050051； 2.河北中医学院药学院，河北石家庄 050200）

小儿泄泻停颗粒由羌活、车前子、苍术、大黄、制大黄、甘草、制川乌7 味药材加工而成，具有健脾化湿、消积止泻的作用，主要用于婴幼儿腹泻的治疗，尤其对小儿脾虚湿蕴食津所引起的大便蛋花汤样或糊状，夹有粘液泡沫、乳块，反复迁延不愈的婴幼儿腹泻效果最佳［1-6］。但该制剂现行质量标准［7］及袁蔼芝等［8］仅对大黄所含成分大黄酸含有量进行测定，未检索到多成分同时定量测定的报道。

小儿泄泻停颗粒中羌活祛风胜湿，升阳补脾，含有挥发油、香豆素、有机酸等化合物，其中紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素为主要成分［9］；车前子利水渗湿止泻，利小便，实大便，含有环烯醚萜、苯乙醇苷、三萜、多糖、苯丙素苷、黄酮类化合物，其中京尼平苷酸为其环烯醚萜类代表性成分，毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为其苯乙醇苷类代表性成分［10-11］；苍术健脾燥湿，含有聚乙烯炔、倍半萜、倍半萜苷成分，其中苍术素醇、苍术素为其聚乙烯炔类主要成分，白术内酯Ⅱ为其倍半萜类主要成分［12-13］；大黄清利湿热，消积导滞，制川乌温中祛寒，甘草调和胃气，诸药合用，共奏健脾化湿、消积止泻之效。因此，本实验首次建立HPLC 法同时测定小儿泄泻停颗粒中紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素的含有量，为该制剂质量标准的提高和完善提供理论依据和实验基础。

1 材料

Waters 2695 型高效液相色谱仪，配置Waters可变波长检测器、Empower 工作站（美国Waters公司）；BP211D 型电子分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-250E 型超声波清洗器（上海量壹科学仪器有限公司）。紫花前胡苷（111821-201604，质量分数99.6%）、羌活醇（111820-201705，质量分数99.9%）、异欧前胡素（110827-201812，质量分数99.6%）、京尼平苷酸（111828-201604，质量分数97.4%）、毛蕊花糖苷（111530-201713，质量分数92.5%）、白术内酯Ⅱ（111976-201501，质量分数99.9%）、苍术素（111924-201605，质量分数99.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；异毛蕊花糖苷（61303-13-7，质量分数95.0%）对照品购自上海纯优生物科技有限公司；苍术素醇（61642-89-5，质量分数99.8%）对照品购自贵州迪大科技有限责任公司。小儿泄泻停颗粒（每袋装2 g，批号1807216、1809104、1809158）购自杭州胡庆余堂药业有限公司。乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备精密称取各对照品适量，甲醇制成每1 mL 分别含紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素2.912、0.674、4.730、1.318、0.896、0.492、0.216、0.958、2.194 mg 的贮备液，各精密吸取2.5 mL于50 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得。

2.2 供试品溶液制备取颗粒适量，研细，精密称取2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇，密塞，称定质量，超声提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.3 阴性样品溶液制备按颗粒质量标准项下处方及工艺，分别制备缺羌活、缺车前子、缺苍术的阴性样品，按“2.2”项下方法制备，即得。

2.4 色谱条件 Kromasil Eternity C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.5%冰醋酸（B），梯度洗脱（0～15.0 min，18.0% A；15.0～28.0 min，18.0%～35.0% A；28.0～46.0 min，35.0%～42.0% A；46.0～64.0 min，42.0%～49.0%A；64.0～75.0 min，49.0%～18.0%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；0～28.0 min 在315 nm［9］波长处检测紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素，28.0～46.0 min 在254 nm［10］波长处检测京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷，46.0～75.0 min 在270 nm［13］波长处检测苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素；进样量10 μL。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离度均大于1.5，理论塔板数按均不低于3 500，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.5.2 线性关系考察精密吸取“2.1”项下贮备液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于20 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得到不同质量浓度对照品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.5.3 精密度试验取“2.2”项下供试品溶液（批号1807216），在“2.4”项色谱条件下进样测定6 次，测得紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素峰面积 RSD 分别为0.59%、0.81%、1.52%、0.75%、1.34%、0.59%、0.96%、1.85%、0.62%，表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5.4 重复性试验取同1 批颗粒（批号1807216）适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素含有量RSD 分别为1.42%、0.59%、1.33%、1.75%、0.48%、1.63%、1.91%、0.61%、1.24%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验取同1 批供试品溶液（批号1807216），室温下于0、1、2、4、8、16 h 在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素峰面积RSD 分别为0.57%、0.86%、1.54%、0.77%、0.33%、0.96%、0.45%、1.83%、0.59%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验精密称取含有量已知的颗粒9 份，每份1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入对照品溶液（含2.016 mg／mL 紫花前胡苷、0.502 mg／mL 羌活醇、3.494 mg／mL 异欧前胡素、0.858 mg／mL 京尼平苷酸、0.606 mg／mL 毛蕊花糖苷、0.332 mg／mL 异毛蕊花糖苷、0.118 mg／mL 苍术素醇、0.654 mg／mL 白术内酯Ⅱ、1.452 mg／mL苍术素）0.5、1.0、1.5 mL，各3 份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，紫花前胡苷、羌活醇、异欧前胡素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、苍术素醇、白术内酯Ⅱ、苍术素平均加样回收率分别为99.12%、98.26%、99.85%、98.79%、98.05%、97.99%、96.98%、98.74%、99.01%，RSD 分别为 0.90%、1.19%、0.87%、1.17%、1.06%、0.97%、1.57%、1.34%、0.94%。

2.6 样品含有量测定取3 批颗粒适量，研细，精密称取2.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表2。

3 讨论

3.1 流动相筛选参照2015 年版《中国药典》一部中羌活、车前子、苍术含有量测定条件，本实验考察了流动相乙腈-水［14-15］、甲醇-0.5%醋酸［10］、甲醇-水［16］，发现各成分色谱峰峰形均存在一定缺陷，故又采用乙腈-0.5%醋酸梯度洗脱［9，17］，同时其比例进行摸索，最终确定为“2.4”项下条件，此时各成分色谱峰峰形较好，而且与相邻杂质峰的分离度均能达到要求。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g，n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3.2 供试品溶液制备方法筛选本实验考察以甲醇［9，13-16，18］、60%甲醇［10，17，19］、稀乙醇为溶剂超声30 min 的提取效果，发现用甲醇提取时不仅各成分综合提取率最佳，而且峰形良好，杂质无干扰，故选择其作为提取溶剂。再考察超声提取［9，13-16］、加热回流提取［10］、室温浸渍过夜提取的效果，发现加热回流提取率略高于超声，但杂质明显更多，而室温浸渍过夜时提取率最低，故选择超声作为提取方法。最后，考察超声时间15、30、45 min，发现提取30、45 min 时提取率相差不大，但均明显优于提取15 min 时，故最终确定供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min。