虞慧华，蔺红伟，陆文铨，陈万生，朴淑娟*

(1.海军军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.海军军医大学长征医院药学部，上海 200003)

线粒体是细胞能量代谢的主要场所，同时对细胞内信号传导和细胞死亡等生命活动具有十分重要的调控作用。任何通过直接或间接作用损伤线粒体结构和功能，即引起线粒体毒性的药物均可能引起严重的不良反应，轻则导致细胞功能紊乱、局部组织细胞凋亡或坏死，重则引起器官衰竭甚至死亡[1]。一些抗病毒药、降脂药、降糖药、抗生素、解热镇痛药和化疗药物等均因线粒体毒性受到美国食品药品管理局(FDA)“黑框”警告或被迫撤出市场。基于此，药物引发的线粒体毒性引起了医药界与监管部门的广泛关注和高度重视。欧盟药品评价管理局、美国FDA等机构推荐或明确要求药物研发过程中应评价药物对线粒体的毒性作用[2]。

毒性评价的传统方法主要是动物体内实验，通过解剖检查、称量重量、计算脏器指数、血液生化学检查及病理形态学检查等来发现受试物的器官毒性，即使用啮齿类动物和非啮齿类动物进行不同时间段的生物测定。虽然这种方法在评估化合物对人类潜在危害的应用中发挥了重要的作用，但随着科学技术的发展，其局限性也逐渐显露出来[3]。动物体内模型通常通量低，价格昂贵且耗时比较长。体外毒性评价由于周期短、成本低和作用机制易于探明等优势得到快速的发展，自动化的高通量检测与筛选更是得到了广泛的应用[4-5]。

高通量筛选(high throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏、快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万份样品进行检测并以相应的数据库支持整体运转的技术体系[6]。目前，高通量毒性评价已成为毒理学和药理学等领域的研究热点，并且在理论研究和实际应用中都发挥着重要的作用。高通量体外筛选，通常比用体内模型进行的分析更有效且更便宜，更利于多种化合物的活性筛选[7]。本文对线粒体毒性评价中应用HTS技术进行的检测方法和手段进行介绍，以期为相关领域的研究提供一定的参考信息。

1 依据线粒体毒性发生机制进行检测

HTS分析的第一步是明确检测目标的生物学机制和化学评估系统。线粒体毒性机制包括破坏线粒体膜电位、线粒体形态和生物功能等[8]。检测线粒体毒性应根据线粒体损伤机制来选择适当的检测方法。

1.1 线粒体探针 线粒体探针是指能够特异性抑制线粒体蛋白的化合物，可用于检测线粒体的功能。最常用的线粒体探针包括哇巴因、鱼藤酮、抗霉素A、寡霉素和三氟甲氧基苯腙羰基氰化物(FCCP)。哇巴因通过与酶结合而抑制Na+/K+-ATPase并引起细胞内钠的增加，线粒体肿胀和耗氧率(oxygen consumption rate，OCR)的降低。鱼藤酮通过阻止电子从铁硫转移到泛醌而抑制电子传递链复合物Ⅰ[9]。抗霉素A抑制电子传递链复合物Ⅲ中细胞色素C还原酶，阻止泛醌的氧化并破坏线粒体质子梯度[10]。寡霉素抑制ATP合成酶的Fo亚基，阻止ADP磷酸化合成ATP，减少电子沿电子传递链的流动。FCCP是一种质子载体，运输氢离子通过细胞膜，使ATP的产生与氧消耗解偶联，导致最大OCR。

这些线粒体探针可以通过各种检测技术单独使用或组合使用，以识别线粒体功能障碍的来源。如使用寡霉素可揭示直接由ATP产生的线粒体呼吸量；使用FCCP能够确定细胞的最大呼吸能力与基础呼吸之间的差异；使用抗霉素A、鱼藤酮和哇巴因可完全破坏线粒体呼吸，从而揭示非线粒体的细胞呼吸量。

1.2 活性氧机制 线粒体功能障碍通常会增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，从而导致炎症、神经变性和衰老。ROS包括超氧自由基、羟基自由基、过氧化氢和单态氧。在正常的生理条件下，ROS的产生和清除受到严格控制，以维持细胞内稳态。破坏线粒体复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可导致ROS产生失衡[11]。活性化合物会导致线粒体内、外脂质过氧化，蛋白质氧化和DNA损伤。有许多方法可以测量ROS，包括化学发光法、荧光探针法和酶活性测定法等[12]。最适用于HTS的检测方法是使用可渗透荧光ROS指示剂，包括dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)，hydroethidine和线粒体超氧化物荧光探针MitoSOX Red(mito-hydroethidine)[12-13]。

上述许多探针不会直接与ROS反应形成荧光产物，从而限制了ROS的直接测定。此外，在细胞内，除线粒体外还有许多ROS来源，因此不能单独以ROS测定结果来判定线粒体功能。

1.3 膜电位机制 线粒体跨膜产生的电化学梯度是生成ATP不可或缺的因素，线粒体毒性的一种机制即为破坏线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)。四甲基罗丹明甲酯(tetramethylrhodamine methyl ester,TMRM)、内质网荧光探针(DiOC6)、线粒体膜电位荧光探针(JC-1)是亲脂性阳离子染料，由于这些染料带正电荷，它们在线粒体内的积累与MMP成反比[14]。通过将线粒体暴露于上述荧光剂之一来评估化合物对MMP的影响，使用荧光酶标仪可对其进行定量检测。荧光成像技术是线粒体HTS最广泛使用的技术，大多数微孔板读板器可容纳96和384孔板，并具有测量荧光吸收和发光的能力，使用荧光探针定量检测MMP破坏的方法已被证实为评估线粒体毒性的有效方法[15]。

荧光探针定量检测MMP作为评估线粒体功能的方法具有较多优势，但是在分析结果时要考虑诸多因素。这些探针可测量跨膜电荷的变化，但无法特异性地测量质子梯度。为了对结果进行有效分析，研究人员必须选择正确的染料，以正确的方法观察细胞，并需要利用适当的对照来确认。此外，除测定MMP外，还需补充测定，如补充测定细胞中的ATP水平和OCR等。

1.4 呼吸测定法 呼吸测定技术在毒理学研究中可以评估毒性物质对代谢和线粒体适应性的影响。通过观察线粒体DNA和酶活性来量化线粒体功能的许多检测模型在检测过程中会破坏实验细胞或组织，而呼吸测定法可使用荧光细胞生存力测定法测量细胞ATP含量来间接评估线粒体功能。在Mg2+、ATP和O2存在的情况下，荧光素被荧光素酶氧化，产生的发光信号与细胞产生的ATP的量成正比，可以使用酶标仪来定量。通过测定ATP的含量来检测细胞生存力和线粒体功能在HTS模型中已广泛使用[16]。最直接的呼吸测定法是测量OCR。OCR的测量是非侵入性的，可以在孤立的线粒体或组织样本中测定，在某些情况下还可用于整个生物体的测定。Clark电极和Oroboros仪器已被广泛用于呼吸测定法。然而，这些方法一次只能检查少量样品，重复性也不理想。使用Seahorse 24孔和96孔细胞外通量分析仪(XF-24和XF-96，Seahorse生物科技公司)使呼吸测定的HTS成为可能[17]。这项技术可以对OCR和细胞外酸化率(extracellular acidification rate，ECAR)的微小变化进行灵敏的测定。

接触有毒物质后，线粒体基础呼吸的变化很难确定，也无法获得有关线粒体最大呼吸容量下降的信息。XF-96分析仪允许在实验过程中注入化学探针，从而能够更具体地分析出线粒体的干扰来源。通过依次加入ATP合酶抑制剂寡霉素、质子解偶联剂FCCP、电子传递链抑制剂鱼藤酮和抗霉素A，XF-96能给出线粒体基础呼吸、ATP周转率、质子泄漏、偶联效率、最大呼吸率、备用呼吸容量和非线粒体呼吸等信息，可以用来确定线粒体毒性发生的特定机制[18]。加入寡霉素可以确定与ATP产生偶合的呼吸分数，加入FCCP能够使线粒体氧化磷酸化解偶联，从而导致最大呼吸，改变线粒体功能的化合物通常会导致最大呼吸速率显著下降。鱼藤酮和抗霉素A可以阻止电子通过电子传递链，OCR的降低提示非线粒体呼吸或电子传递链功能障碍而导致质子泄漏[18]。

细胞、组织和整个生物体都可以在XF仪器中测量。这项技术代表了高通量评估细胞线粒体功能的重大进步，现已用于多种线粒体HTS分析[19]。线粒体呼吸是一个复杂的过程，用于评估线粒体功能的化学探针也会破坏整个细胞内的其他细胞器。因此，实验设计时要适当使用阳性和阴性对照进行比较分析，以便更准确地对数据进行解释。

1.5 细胞形态学检测 线粒体形态受融合、分裂和线粒体自噬的影响，线粒体的天然异质性会影响细胞功能和对毒性物质的敏感性。有毒物质的接触可通过影响线粒体功能、形状和数量来改变线粒体亚群的平衡。线粒体自噬是在线粒体损伤或细胞应激后线粒体的降解和循环。线粒体自噬的结构和蛋白质动力学可以通过多种方法进行评估，包括透射电子显微镜、蛋白质印迹和荧光显微镜[20]。HTS可以通过使用荧光探针壬基吖啶橙(NAO)来测量线粒体中心磷脂的含量，并使用TMRM或MitoTracker来确定膜电位，从而检测线粒体结构的完整性。高通量荧光显微镜最适合形态学HTS检测，流式细胞仪的应用也取得了显著进展。流式细胞术是一种分析细胞和细胞器形态的有效方法，每秒可评估样品中的数千个线粒体，因此流式细胞仪具有很高的通量，已被广泛用于线粒体毒性物质的筛选。最新式的流式细胞仪可以整合96、384和1536孔板，从而使该技术得以用于线粒体的HTS分析[21]。

流式细胞术HTS法是一种有效的线粒体形态学评价方法，但是由于频繁使用分离的线粒体而使其具有一定的局限性，因为线粒体在分离过程中可能发生改变或丢失，从而使形态学的检测结果不准确。

2 线粒体毒性评价模型

一直以来，毒理学家认为实验动物能提示人类的某些潜在反应，因此常常依靠啮齿类动物体内模型来评估药物毒性。动物实验虽然提供了有价值的毒性数据，但动物模型通常通量很低，价格昂贵且耗时比较长。用分离的细胞器或培养的细胞进行体外实验也可以获得有关毒性机制的有价值的数据[22]。体外HTS通常比在体内模型进行的分析更有效且更便宜，更利于多种化合物的毒性筛选。

2.1 离体线粒体检测模型 离体线粒体检测通常用于评估化合物对线粒体功能的影响。为了确定线粒体毒性在特定器官中的作用，可以将线粒体分离自感兴趣的器官，并在化学暴露后检查其形态和功能[23]。使用分离的线粒体来测量化合物对氧气消耗的影响，可以避免细胞或整个生物体中存在任何非线粒体呼吸源，包括过氧化物酶体对呼吸的影响。然而，离体线粒体存在许多实验上的缺点，使其难以用于HTS毒性实验中。通常离体线粒体通过细胞裂解分离，然后经过离心分离和纯化，这种分离过程可能在检测之前破坏线粒体，从而使结果不准确。此外，为了获得高质量的线粒体，需要大量的组织，并需在低于4 ℃的温度下给药，以维持线粒体功能。在分离的线粒体中检测氧化磷酸化并不包括代谢和细胞信号传导的影响，因此提供的信息也并不完整。

2.2 细胞检测模型 体外毒性模型通常使用永生化细胞系并在含有葡萄糖的培养基中培养。尽管方便，但这些培养条件导致细胞不能模拟在体内发现的某些线粒体功能。许多永生化细胞系来自癌细胞，因此可能会表现出瓦氏效应(Warburg effect)。癌细胞即使在充足的氧气存在条件下，也会偏向使用糖酵解取代一般正常细胞的有氧循环[24]。因此，肿瘤细胞系对线粒体呼吸的依赖性较小，对线粒体毒物的抵抗力更强，这降低了它们在检测线粒体毒性的HTS分析中的实用性。

尽管原代细胞培养耗时且价格昂贵，但它们是研究化合物对线粒体功能影响的高通量分析的理想选择。当在供氧增加和低葡萄糖或无葡萄糖培养条件下生长时，原代细胞通常保持分化功能，并表现出与体内线粒体相当的呼吸和糖异生速率。与啮齿类动物体内实验相比，人类原代细胞更能表现出与人类相关的线粒体毒性。

2.3 葡萄糖和半乳糖不同培养条件模型 永生化细胞和原代细胞的有氧呼吸水平取决于它们的培养条件。糖酵解只产生ATP的小部分。生物体内的大多数细胞都依赖于氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)生成能量。但是，许多癌细胞却是糖酵解活性增强，乳酸生成水平较高[24]。研究表明，一些癌细胞可以根据培养基中葡萄糖的水平在有氧糖酵解和氧化代谢之间切换[25]。癌细胞具有在高浓度葡萄糖环境中抑制呼吸和氧化磷酸化的能力，这种对糖酵解的偏爱效应被称为Crabtree效应(又称为葡萄糖效应)。因此，依靠糖酵解产生能量的细胞对线粒体扰动的敏感性较低，这对于检查和鉴定线粒体毒性物质是一项重大挑战。

解决该问题的一种方法是在细胞培养基中用半乳糖替代葡萄糖。半乳糖被氧化为丙酮酸的速度比葡萄糖慢得多，迫使细胞依赖OXPHOS来产生必需的ATP。这种方法尽管有效，但在细胞培养中使用半乳糖却有局限性，因为某些细胞无法分解半乳糖以产生能量。此外，当OXPHOS被线粒体毒性物质阻断时，细胞需要糖酵解才能存活。当细胞暴露于可破坏无葡萄糖培养基中OXPHOS的化合物时，它们将无法进行糖酵解并迅速死亡，这会导致在长时间暴露期间难以区分线粒体毒性物质还是细胞毒性物质，从而得到假阴性的结果[26]。最近的研究试图通过使细胞在两个阶段中生长来克服Crabtree效应，即低浓度葡萄糖的初始糖酵解阶段和葡萄糖耗尽后消耗乳酸的OXPHOS阶段[27]。初始培养时，葡萄糖提供了细胞增殖所必需的营养成分以维持细胞生存，而后放置于无葡萄糖的培养基中培养时，细胞对线粒体毒性物质的敏感性增加[28]。

3 小 结

线粒体毒性评价是每年对进入市场的数百种药品进行有效管理的关键。因此，高效率、大规模的线粒体毒性分析至关重要。高通量线粒体毒性评价是在综合传统方法和新技术的基础上，实现对受试物线粒体毒性的高效、快速检测以及对目标物的高通量、有目的的检测与筛选。当然，HTS模型作为药物研究的一种方法，并不是一种万能的手段，尤其是体外筛选模型，不可能充分、全面反映药物的药理作用。但通过HTS标记为线粒体毒性的化合物可以优先进行进一步的研究，以用于包括啮齿类动物实验在内的二级测定，以便更准确地预测未知化合物的线粒体毒性。