徐雯 沈起钧 单嫣娜 赖旭峰 陈文辉

抑郁是糖尿病的常见并发症之一。糖尿病患者的抑郁与亚临床抑郁症状发生率显著高于普通人群，且其药物依从性及血糖控制较差，导致并发症的发生风险升高［1］。慢性应激是抑郁及其它应激相关情绪障碍的重要发病因素，其所导致的脑内解剖结构、电生理及神经化学等多个方面的变化，已被研究证实与糖尿病并发认知功能障碍模型中观察到的相关变化类似［2］，提示慢性应激可能与糖尿病相关认知障碍及其它中枢神经系统并发症的发生发展密切相关。已有大量研究证明海马与认知功能密切相关，且糖尿病及慢性应激刺激均可导致海马解剖结构、神经元可塑性以及代谢调控等一系列病理生理变化［3-4］。然而，目前关于慢性应激刺激背景下糖尿病大脑中海马的代谢变化情况的相关报道相对较少。本研究旨在应用核磁共振氢谱（1H NMR）检测慢性不可预测轻度应激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）对糖尿病大鼠海马代谢的影响，为糖尿病并发抑郁的发病机制研究提供基础，并为相关临床治疗提供理论依据及新思路。

1 资料与方法

1.1 实验材料 （1）实验动物：20 只普通级雄性Wistar 大鼠（6 周），许可证编号：SYXK（浙）2010-0150，体重155.2～168.7g，平均（163.4±3.89）g，每笼4 只。置于安静舒适实验环境，普通饲料饲养，自然昼夜节律光照，平均室温22℃～25℃，空气湿度50%～60%，并可自由进食进水。（2）主要药品、试剂及仪器：Bruker AVANCE III 600 核磁共振谱仪（Bruker BioSpin International AG）；血糖仪（德国贝朗医疗国际贸易有限公司）；冷冻干燥机（FD-1，北京德天佑科技发展有限公司）；匀浆机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）。

1.2 研究方法 （1）动物分组及模型建立：所有大鼠禁食16h 后一次性腹腔注射STZ（溶于新鲜配制的0.1mol/L，pH=4.5 枸橼酸缓冲液中，4℃保存）64mg/kg。注射后72h 尾静脉采血测血糖，随机血糖＞16.7mmol/L 并保持＞3d 即成功建立糖尿病大鼠模型。随后按随机数字表进行分组：糖尿病组（即DM 组，n=6 只）、糖尿病慢性应激组（即DC 组，n=14 只）。将所有DC 组大鼠每日暴露于一种CUMS 方法［5］并持续4 周，应激包括群居饲养（7 只/笼）、潮湿垫料（500ml/笼）、鼠笼倾斜40°、夹尾1min、频闪光照（300 flashes/min）6h、白噪音［（80±5）db］6h、4℃冰水游泳5min。DM 组不做处理，每日自由进食进水。CUMS 处理完成后，两组大鼠进行行为学评估［6］。（2）行为学实验：包括Open-field 实验及Morris 水迷宫实验。Open-field 实验：将大鼠放入底面划分成25 个面积相等方格的敞箱正中格，使其自由活动5min 并同时进行摄像和计时。Morris 水迷宫空间探索实验：直径1.5m 的圆形水池，平台直径0.13m，水深0.3m，水面高出平台2cm。连续训练4d，每次将大鼠贴壁放入水中，观察并计时60s，若60s 内未找到平台，则引导其至平台，停留15s。第5 天撤除平台，将大鼠从距原平台最远的象限面壁放入水中，摄像系统记录大鼠在60s 内活动数据。（3）海马组织的制备及1H NMR 检测：所有大鼠在行为学实验后断头处死，并将收集的海马组织样本浸入液氮中急冻，置于-80℃保存。冰冻的海马组织样本在提取水溶性的小分子代谢物后，在液氮中冷冻，并放入真空冻干机中冻干24h。将得到的代谢物粉末重新溶解，低温离心后取上清液，转入NMR 样品管中进行测试。使用Bruker AVANCE III 600MHz NMR 谱仪采集组织样本的1H NMR 谱。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t 检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠一般情况及体重变化 两组大鼠进食及饮水量增加，体质量逐渐下降，明显消瘦，毛色晦暗，二便增多，DC 组大鼠精神萎靡，反应迟钝。两组大鼠于应激前后均始终保持高水平随机血糖（＞33.3mol/L）。以应激前后大鼠体质量作为监测指标，两组大鼠体质量均呈下降趋势，两组之间差异无统计学意义（P＞0.05，见图1）。

2.2 两组大鼠行为学实验比较 （1）Open-field 实验：DC 组大鼠的总路程、活动时间及活动次数均较DM 组减少（P＜0.05，见图1）。（2）Morris 水迷宫实验：在空间探索实验中，DC 组大鼠的站台穿越次数较DM 组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图1）。

图1 慢性应激刺激后两组大鼠体质量变化［g，（）］及行为学实验结果比较（注：与DM组比较，DC组在Open-field实验中的活动次数（a）、活动时间（b）及总路程（c）明显减少；在Morris水迷宫探索实验中，DC组的站台穿越次数较DM组明显减少（d）。CUMS处理第0、14、28天，DC组与DM组大鼠体质量均无显著差异。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）

2.3 两组NMR 波谱和统计学分析 两组大鼠海马的典型1H NMR 波谱图见图2。两组大鼠海马提取物1H NMR 谱中谱峰的归属参照文献［7］。与DM 组相比，DC 组大鼠海马中的谷氨酸及谷氨酰胺含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1），其余所测得代谢物于两组之间差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

图2 两组大鼠海马的典型1H NMR波谱图

表1 1H NMR方法分析两组大鼠海马中各代谢物含量［mmol/kg，（）］

表1 1H NMR方法分析两组大鼠海马中各代谢物含量［mmol/kg，（）］

代谢物 谱峰（ppm） 海马DM组 DC组 P值Lac δ1.31-1.34 103.49±4.94 101.92±6.34 0.66 Ala δ1.46-1.49 5.52±0.81 6.01±0.41 0.05 NAA δ2.01-2.02 33.60±1.81 34.00±2.13 0.74 GABA δ2.27-2.31 9.39±0.69 9.64±0.35 0.32 Glu δ2.33-2.38 41.61±1.83 44.33±1.41 0.01 Suc δ2.39-2.41 2.90±0.56 3.41±0.60 0.15 Gln δ2.45-2.50 18.66±0.72 19.55±0.66 0.03 Asp δ2.80-2.82 4.07±0.18 4.50±0.54 0.15 Cre δ3.03-3.05 48.57±2.23 48.75±2.01 0.88 Cho δ3.19-3.20 2.22±0.50 2.00±0.35 0.32 Tau δ3.40-3.44 27.35±1.39 27.03±1.73 0.73 Gly δ3.54-3.56 3.31±0.18 3.27±0.24 0.75 m-Ins δ3.60-3.64 32.84±1.53 33.23±1.17 0.59

3 讨论

本研究采用一次性腹腔注射STZ 建立糖尿病模型，之后利用CUMS 方法模拟慢性应激环境，实验中观察到两组大鼠均出现进食及饮水量增加，体重下降，毛色晦暗，二便增多等典型糖尿病症状，而DC 组又表现出精神萎靡、反应迟钝等抑郁样症状。CUMS 方法模拟了日常生活中的慢性应激事件，其已被大量研究证实可使实验动物产生类抑郁状态［5］。Open-field 实验是基于啮齿类动物同时有畏惧空旷场地和探究新事物、新环境的天性，用于评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。本研究中，DC 组大鼠在实验中的活动总路程、活动次数及活动时间均较DM 组大鼠明显减少，反映其对未知环境的好奇程度及探索能力明显下降。Morris 水迷宫广泛用于评价啮齿类动物空间位置感及方向感的学习及记忆能力。本研究中，DC 组大鼠在第5 天的空间探索实验中穿越平台位置的次数较DM 组明显减少，表明其对平台位置及方向的学习记忆能力明显下降。上述DC 组大鼠的行为学表现与临床上慢性应激引起的抑郁状态患者出现情绪低落、兴趣缺失、学习记忆力减退的症状相符，进一步验证了模型的可靠性。

质子核磁共振是一种强大的用于研究脑能量代谢、神经传递和神经胶质-神经元相互作用的方法。离体1H NMR 技术在检测灵敏度、区域特异性和代谢物谱峰的分散方面较在体NMR 技术有明显优势。与核磁共振波谱相比，由于离体1H NMR 技术在超高场强下运行，因此除了可以提供更全面、更准确和更多样的代谢信息外，亦能对目标代谢物进行绝对定量分析，这有助于更精确的判断代谢物的变化趋势。1H NMR 避免了对生物样品的损伤，减少了分离纯化等操作，在不影响其代谢变化的条件下，给出了组织内Glu、Gln、GABA、Cre、NAA、Cho、Gly、Asp、Ala、Lac、Tau 等神经化学物质的信号［7］。

海马是参与认知能力、近期记忆、学习和注意力的重要脑区，神经影像学研究表明糖尿病及慢性应激均可影响海马的结构、神经递质、突触可塑性及神经电生理等，与认知功能障碍的发生关系密切［8-9］。在代谢层面上，以往关于糖尿病或慢性应激相关的抑郁所导致的多个脑区的代谢物变化已有大量报道，但尚未发现有关于慢性应激背景下糖尿病大鼠海马代谢改变的相关报道。本研究利用1H NMR 方法进行检测后发现慢性应激刺激后的糖尿病大鼠海马中谷氨酸及谷氨酰胺水平较无慢性应激刺激的糖尿病大鼠明显增高。这一结果可能与海马神经元谷氨酸释放量增加及突触间隙谷氨酸清除障碍有关［10-12］。作者认为慢性应激是引起糖尿病大鼠海马谷氨酸水平升高的重要因素，其可能在糖尿病合并抑郁的发病过程中起到重要作用。

本研究的不足之处在于缺乏对该过程中海马神经元EAAT 表达情况变化的探究，这也是本课题组下一步的研究方向，即采用RT-PCR 技术对糖尿病慢性应激大鼠海马神经元谷氨酸转运体EAAT 的核酸表达进行检测，进一步阐明慢性应激对糖尿病大鼠海马谷氨酸代谢产生的影响。

综上所述，本研究运用1H NMR 技术检测了慢性应激状态下的糖尿病大鼠模型的海马代谢变化情况，为糖尿病合并抑郁的发病机制研究提供了一定的理论基础及潜在的治疗靶点。