阿霉素属于蒽环类抗生素，广泛应于白血病、淋巴瘤以及实体瘤等的治疗[1-2]。然而，阿霉素的心脏毒性限制了其临床应用。应用阿霉素后的心脏功能障碍在治疗期间或治疗停止后数周至数年内出现，其心脏毒性可表现为心包炎、心律失常、充血性心力衰竭以及治疗后即会出现的可逆性低血压，长期应用阿霉素治疗死亡率超过50%[3-4]。阿霉素诱导的心脏毒性可能涉及多种途径，其中阿霉素诱导的线粒体功能障碍是其诱导心脏毒性的关键[5]。阿霉素对心磷脂具有高亲和力，与心磷脂结合后可进入线粒体，抑制呼吸链功能，最终引起心肌细胞凋亡[6-7]。

黑芥子苷是十字花科植物如西兰花中天然存在的葡萄糖苷类营养成分，具有抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤和抗炎作用[8-10]。研究发现，黑芥子苷还可在抗动脉粥样硬化中发挥重要作用[11]，但其是否能预防阿霉素引起的心脏毒性尚不清楚。本研究探讨黑芥子苷对阿霉素所致心脏毒性的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

32只10周龄C57/BL6成年雄性小鼠购于中国医学科学院实验动物研究所，体质量23.5～27.5 g，SPF级。黑芥子苷购于上海融禾公司，批号64550-88-5，纯度>98%；3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体、p38丝裂原激活蛋白激酶(T-p38)抗体、磷酸化的p38丝裂原激活蛋白激酶(P-p38)抗体、c-Jun氨基末端激酶(T-JNK)抗体、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(P-JNK)抗体、Bax抗体和Bcl-2抗体等一抗均购于美国CST公司；荧光标记羊抗兔二抗购于美国LI-COR公司；化学发光蛋白检测显影液购于美国Borad公司。

1.2 实验分组

实验小鼠购回后，适应环境1周，随机分为对照组、黑芥子苷组、阿霉素组和黑芥子苷+阿霉素组，每组各8只。阿霉素组和黑芥子苷+阿霉素组小鼠给予单次腹腔注射阿霉素(15 mg/kg)，对照组和黑芥子苷组给予单次腹腔注射生理盐水(15 mg/kg)，黑芥子苷组和黑芥子苷+阿霉素组小鼠同时用黑芥子苷5 mg/kg灌胃，每2天1次，共3次。本实验经动物护理和使用委员会批准。

1.3 超声心动图检测

腹腔注射后第7天，采用多普勒心脏超声检测4 组小鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数 (LVEF)以及左室短轴缩短率(LVFS)。

1.4 Western blot检测

小鼠称重并记录后处死，沿胸骨中线剪开皮肤，充分暴露心脏后取出心脏，将心腔内血液轻轻挤出，称量心脏质量。将各组心脏组织溶解于裂解缓冲液中，采用BCA法测量蛋白浓度，蛋白经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育40 min，ECL显影。使用ImageJ软件对蛋白表达水平进行定量，GAPDH为内参蛋白。

1.5 统计学分析

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用两独立样本的t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黑芥子苷对阿霉素所致心脏毒性的保护作用

黑芥子苷组与对照组小鼠超声心动图各指标的差异无统计学意义。与对照组相比，阿霉素组小鼠LVEDD、LVESD均明显增大，而LVEF和LVFS均明显减小(P均<0.05)。与阿霉素组相比，黑芥子苷+阿霉素组小鼠LVEDD、LVESD均明显减小，LVEF和LVFS均明显增大(P均<0.05)。见表1。

2.2 黑芥子苷减轻阿霉素所致心肌细胞凋亡

Western blot结果显示，黑芥子苷组与对照组小鼠凋亡相关蛋白表达水平的差异无统计学意义。与对照组小鼠相比，阿霉素组小鼠心肌Bax表达水平明显升高，Bcl-2表达水平明显降低(P均<0.05)；与阿霉素组相比，黑芥子苷+阿霉素组Bax表达水平明显降低，Bcl-2表达水平明显升高，(P均<0.05)，见图1、表2。

表1 各组小鼠心功能比较

注：与对照组比较，(1)P<0.05；与阿霉素组比较，(2)P<0.05

图1 各组凋亡相关蛋白表达情况

表2 各组小鼠凋亡相关蛋白表达水平比较

注：与对照组比较，(1)P<0.05；与阿霉素组比较，(2)P<0.05

2.3 黑芥子苷通过p38/JNK MAPK减轻阿霉素的心脏毒性

Western blot结果显示，黑芥子苷组与对照组小鼠MAPK信号通路相关蛋白表达水平的差异无统计学意义。与对照组相比，阿霉素组小鼠心肌中磷酸化的p38和JNK的表达水平明显升高(P均<0.05)；与阿霉素组相比，黑芥子苷+阿霉素组磷酸化的p38和JNK的表达水平明显降低(P均<0.05)。见图2。

图2 各组MAPK信号通路相关蛋白表达情况

表3 各组小鼠MAPK信号通路相关蛋白表达水平比较

注：与对照组比较，(1)P<0.05；与阿霉素组比较，(2)P<0.05

3 讨论

本研究探讨黑芥子苷对阿霉素诱导的心脏毒性的潜在保护作用，并阐明这种保护作用的可能机制。LVEF和LVFS的下降是阿霉素诱导的心脏功能降低的表现[12]。我们的研究发现阿霉素诱导心脏功能恶化，表现为LVEF和LVFS的降低，而使用黑芥子苷干预后，小鼠心功能明显改善。

体外和体内研究表明，阿霉素诱导的心脏毒性与心肌细胞凋亡和坏死有关[13-15]。线粒体是阿霉素诱导心肌细胞自由基毒性的靶点[16]。阿霉素可引起线粒体通透性转换孔(mPTP)开放，允许小分子通过线粒体膜，导致线粒体三功能蛋白(MTP)崩溃，进而引起线粒体肿胀和破裂，促细胞凋亡分子释放到胞质中[17]。线粒体在阿霉素诱导的心肌病的发病机制中起重要作用，预防线粒体功能障碍可影响心肌改变，使心脏出现好的转归[18]。在本研究中，我们观察到阿霉素使促凋亡蛋白Bax表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，但黑芥子苷干预可减弱阿霉素介导的促凋亡现象。

MAPK在细胞增殖、分化和死亡中起重要作用。MAPK家族由3个成员组成：细胞外信号调节激酶(ERK)，JNK和p38。MAPK信号通路是通过氧化应激触发细胞凋亡的主要中间体。JNK和p38参与阿霉素诱导的氧化应激反应[7,19]。因此，我们研究了黑芥子苷对p38/JNK MAPK信号通路的影响。在本研究中，经阿霉素作用后，心脏组织p38和JNK的磷酸化水平升高，而黑芥子苷抑制了阿霉素诱导的JNK和p38的磷酸化。

在本研究中，我们使用黑芥子苷干预阿霉素诱导的心脏毒性，结果表明黑芥子苷通过p38/JNK MAPK信号通路发挥心脏保护作用，这为黑芥子苷减轻阿霉素诱导的心脏毒性提供了理论依据。