郭琦，沈卫锋，楼宝

(浙江省农业科学院 水生生物研究所， 浙江 杭州 310021)

虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei, EHP)，属于真菌界、微孢子虫门(Microspora)、单倍期纲(Haplophasea)、壶孢目(Chytridiopsida)、肠胞虫科(Enterocytozoonidae)、肠胞虫属(Enterocytozoon)[1-2]，是一种专性细胞内寄生生物，其生活史一般包括感染期、增殖期和孢子繁殖期3个阶段[3-4]。虾肝肠胞虫成熟孢子呈椭圆形，大小约为0.7 μm×1.1 μm，孢子具有一个细胞核，极丝5～6圈，一个后位空泡，一个锚状物粘附在极丝上，和较厚的电子致密的孢子壁[1，5]。EHP的孢子壁由3部分组成，分别是一层细胞膜，一层较厚的电子密度低的孢子内壁(10 nm)和一层较薄的电子致密的孢子外壁(2 nm)。扫描电镜观察发现，孢子外壁并不光滑，其上布满细小褶皱和大量白色瘤状物，疑似胞壁蛋白[1，5]。

2000年，研究人员在泰国生长缓慢的斑节对虾(Penaeusmonodon)上发现了一种未知的微孢子虫[6]，其超微结构特征符合肠胞虫科，胞原质团(plasmodia)在细胞质中的位置以及小亚基核糖体RNA序列(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)与比氏肠胞虫(Enterocytozoonbieneusi)相比存在16%的差异，被认为是一个新种，将其命名为虾肝肠胞虫[1]。

近年的研究发现，EHP可以感染斑节对虾和凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)等养殖虾类，导致其生长缓慢，且症状随着感染的增加而加重，可能引起对虾的慢性死亡[1，7-8]。

目前，EHP已经在全世界各地的虾养殖场中被检测到，而EHP流行已经对印度、泰国、中国、越南、马来西亚、印度尼西亚等亚洲各国的养殖虾业造成了严重的经济损失[7，9-15]。本文重点就虾肝肠胞虫的传播途径、检测方法和防治方面研究进展做综述，旨在为今后高效检测和防控EHP提供参考。

1 EHP的危害及传播途径

1.1 垂直传播

EHP可以通过垂直传播途径即侵染亲虾的卵巢传播至下一代。有研究发现，在感染EHP的凡纳滨对虾F1代的无节幼体、蚤状幼体第一期和第二期中均能检测到EHP的存在[16]。

1.2 水平传播

EHP的水平传播途径相对复杂，目前已知健康虾可以通过取食病虾残体、与病虾合养等方式感染EHP，而在实验室条件下通过饲喂病虾肝胰腺组织或者注射纯化的EHP对虾血淋巴中也可使健康虾感染EHP[16-19]。自然条件下，EHP可能存在多种传播介体，健康虾可通过取食携带EHP的介体而被感染，目前已有研究显示卤虫可携带EHP[20]。在自然和实验室条件下感染EHP的凡纳滨对虾中，通过组织学检验仅能在肝胰腺和中肠中观察到EHP，而PCR检测结果显示，凡纳滨对虾的所有组织和器官中均可检测到EHP，包括肝胰腺、中肠、血淋巴、鳃、肌肉和心脏等[18，21]。

目前对于EHP在虾体内的侵染路径尚无系统性研究，研究主要集中于EHP在虾肝胰腺中的分布情况、EHP感染虾肝胰腺的过程和该过程中参与的蛋白。EHP可以通过侵染斑节对虾的肝胰腺上皮小管细胞进入其细胞质，并在其中完成生活史[1]。在EHP侵染虾肝胰腺的过程中，EHP的胞壁蛋白EhSWP1可以和虾肝胰腺上皮小管细胞表面的肝素(heparin)结合，再通过激发极管侵染虾的细胞[22]。

1.3 EHP对宿主的影响

EHP被怀疑与斑节对虾、凡纳滨对虾和罗氏沼虾的生长迟缓症状相关[23]。EHP侵染凡纳滨对虾肝胰腺后，可以引起血淋巴中的总蛋白量和白蛋白量显著上升，肝损伤指标丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸转氨酶(asparate transaminase, AST)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的量显著上升，且感染EHP的虾体质量显著低于健康虾[18]。

2 EHP检测方法

由于EHP孢子较小，在光学显微镜常规镜检下难以发现及鉴定，利用分子生物学技术是目前可行且具有灵敏度高、特异性好、检测速度快等优点的检测方法。

2.1 PCR检测技术

目前最常用的检测虾体内携带EHP情况的方法即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。研究人员已经建立基于18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA，18S rRNA)基因[24]、小亚基核糖体RNA(small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA)基因[25]和胞壁蛋白(spore wall protein，SWP)基因序列[26]的PCR检测技术，为了提高灵敏度和特异性，多数EHP检测过程中会采用巢式PCR(nested-PCR)的方法。国内研究人员对这3种方法在检测凡纳滨对虾、卤虫和水样中EHP的结果进行了比较，发现18S-PCR在第一步扩增时的灵敏度最高，而后2种方法均未检出条带；在第二步扩增上，SSU-PCR的灵敏度显著高于SWP-PCR，但在分析了阳性PCR产物的测序结果后，发现SSU-PCR存在假阳性条带，因此，SWP-PCR的扩增特异性最高[27]。国外学者对SSU-PCR和SWP-PCR的检测灵敏度也进行了比较，以连接SSU rRNA或SWP基因序列的pGEM-T质粒为模板，利用巢式PCR技术，结果显示，SSU-PCR技术只能检测到质粒拷贝数为106以上的模板，而SWP-PCR可以检测最低拷贝数为104的模板；在对与EHP的SSU rRNA序列相似性较高的其他微孢子虫的PCR检测过程中，SSU-PCR会出现假阳性的情况，而SWP-PCR的特异性很好[26]。因此，在检测虾携带EHP情况过程中，建议使用SWP-PCR技术。

2.2 定量PCR技术

目前已经建立的用于EHP检测的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)方法分别是SYBR Green I和TaqMan实时荧光定量PCR检测方法[8，28]。以Ct值≤30时检测结果判定为阳性，TaqMan实时荧光定量PCR方法对EHP标准质粒的检测灵敏度为每μL 5.20×102拷贝数[28]，而SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的检测灵敏度为每μL 8.3×103拷贝数[8]，因此TaqMan qPCR方法的检测灵敏度约为SYBR Green I qPCR方法的10倍左右。利用定量PCR检测方法，不仅可以更灵敏的检测EHP，也可以研究体长与EHP载量之间的关系，从而评估对虾生长速率的风险水平[8]。

2.3 环介导等温扩增反应

由于巢式PCR检测方法和SYBR或Taqman定量检测方法耗时较长，花费较高，且需要特定仪器进行实验，2013年泰国学者建立了检测EHP SSU rRNA基因的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，该方法使用纳米金探针，所需实验时间仅为50 min，灵敏度为巢式PCR的10倍，实验结果直接可视且特异性良好[29]。随后，2017年印度学者建立了实时定量LAMP检测方法，其灵敏度与实时定量荧光PCR检测方法相当，约为巢式PCR的100倍[30]。2018年印度学者建立了使用SYBR green I染料的可视化LAMP检测方法，所需实验时间更短，相比于巢式SWP-PCR检测结果，LAMP的灵敏度约为其的95.31%，特异性约为98.98%，这对于田间检测EHP来说是一种可利用的方法[31]。

2.4 组织学检测方法

除了分子生物学检测方法之外，病理检测也是一种诊断病原和观察病原宿主组织病理变化的重要方法，而良好的染色方法有利于研究人员将病原体与组织区分开，增加组织切片中病原的检出率。目前最常用于检测病理切片中EHP的染色方法为苏木精-伊红(haematoxylin and eosin, HE)染色法[1，18，24]。研究人员为了筛选出一种适用于EHP病理切片检测的最佳染色方法，对包括苏木精-伊红(HE)染色法、Masson染色、爱显蓝-雪夫(AB-PAS)染色法、甲苯胺蓝(TB)染色法、伟赫夫范吉森(EVG)染色法、劳克监牢蓝(LFB)染色法、天狼星红(Sirius red)染色和普鲁士蓝(PB)在内的8种染色方法进行了比较，发现HE染色法对孢子的染色效果较差、与背景颜色对比不明显且单个视野检出率较低，而Masson染色结果显示孢子呈现品红色、与组织颜色对比明显且检出率最高。Masson染色法最适用于EHP病理切片检测[32]。

由于微孢子虫在HE染色处理后的病理切片中形态结构相似，难以区分EHP与其他微孢子虫，其特异性上不如分子生物学检测方法，因此，研究人员建立了原位杂交(in situ hybridization，ISH)检测方法用于EHP的病理切片检测[24]。利用带有地高辛标记的EHP-18S rRNA探针进行原位杂交实验，研究人员可以在感染EHP的凡纳滨对虾肝胰腺上皮小管细胞中观察到阳性标记，而使用棉虾病探针进行原位杂交时则没有阳性标记，证明该方法具有特异性[24]。

3 EHP防治

目前尚无能够有效防治虾体内EHP的报道，但根据EHP的流行病学特性，可以从以下几个方面对EHP的传播进行干预。首先，由于EHP存在垂直传播的特性，因此，需要从源头对EHP进行预防，即选育无EHP的亲虾，育种不携带EHP的虾苗，同时科技人员需要检测出厂的虾苗，及时为农户提供信息。其次，由于EHP可以通过虾的排泄物进入水体，因此，对于使用时间比较长的养殖塘，农户需要进行严格消毒，以清除残留在塘底淤泥中的病原物。Aldama-Cano等[33]发现，在几种不同条件下可以完全抑制EHP的孢子释放(spore extrusion)，当在-20 ℃条件下处理2 h以上、在15 ppm的KMnO4溶液中处理15 min、在40 ppm的65%活性氯中处理15 min、在10 ppm的65%活性氯中处理24 h或在20%的乙醇中处理15 min时，EHP的孢子释放率100%被抑制，这些方法对于虾类养殖前的养殖场消毒或养殖过程中的循环水处理具有参考价值。此外，有研究发现控制水体的氨氮浓度在6.0～9.0 mg·L-1时可以有效减少凡纳滨对虾EHP的携带量[34]。由于病虾可能在养殖过程中被健康虾取食，EHP则可通过该途径进行水平传播，因此，农户需要及时处理病死虾或可通过套养鱼类来取食行动缓慢的病虾，从而有效控制疾病扩散。最后，可以通过增强养殖虾的体质来增加其对病原物的抵抗力，例如在饲料中添加水产用维生素和钙片，或者利用RNA干扰的方法，提前让虾摄入抑制EHP孢子释放的双链RNA，增强虾对EHP的抵抗力。综上，防治虾肝肠胞虫需要遵循“预防为主、防治结合”，优先选育无EHP亲虾和虾苗，结合养殖塘严格清理、水源控制、病虾及时清理和增强虾体质，做到“无病预防，有病早治”。