高 乐

（中科辐环境检测（北京）有限公司，北京 100020）

根据微生物在生态系统中的重要作用，环境学家和生态学家研究了解微生物在生态系统聚集中的动态变化。研究方法的进步加速了研究人员对微生物的了解。近十几年来，微生物研究方法不断发展，特别是高通量测量技术、基因组学和单细胞水平的二次离子交换法等。纳米材料的光谱学结合荧光，随着研究方法的发展，微生物在生态系统中的作用可以更加有效。

1 环境微生物多样性分析

在许多微生物生态学研究中，首先是对所研究环境中的微生物进行分析，传统的微生物研究方法是采集环境样品，然后进行繁殖。然而，现有的培养方法很难得到，因此对微生物多样性的分析受到限制。获得目标基因的PCR 产物后，可根据需要选择以下方法进行微生物多样性分析。

1.1 梯度凝胶电泳（PGGE）和末端限制性片段长度（T-RFLP）多态性

DGGE 和T-RFLP 是环境中微生物多样性分析的早期分子，梯度凝胶电泳主要用于分析500bp 片段，克隆库和测序旨在获得系统开发中感兴趣的条带或物种的信息，但对于复杂的微生物群落。例如，土壤的T-RFLP 分辨率高于梯度凝胶电泳。

1.2 微阵列基因

芯片用于分析样品组成和微生物多样性已有近20年的历史，经过一代又一代的改进。一般来说，微电路和微阵列用于识别系统芯片、研究功能遗传学和功能多样性，微处理器用于将DNA 与已知的短序列样本混合。确保系统的开发或功能，或通过系统开发或同时运行。用荧光标记的PCR 产物或随机引物将样品序列（靶片段的DNA 或RNA）与探针杂交后，可根据荧光探针的序列匹配率计算微生物多样性和信息丰富度。

基因微阵列法特别适用于鉴定不同时间、地点和过程中具有代表性的微生物或微生物群落之间的差异。除了功能微阵列，它还可以量化C，N，S 和P 循环的变化，有机污染物的降解，以及应激反应。本研究利用三代系统芯片（16sRNA基因芯片，可提供60000个不同OTUs 的信息）对土壤中不同的实验性微生物和产甲烷菌进行了研究，以及研究了多样性及其与土壤甲烷通量的关系。该方法不仅可以检测出目标社区在不同时间、不同地点、不同氮水平下的治疗方法，而且可以检测出社区中的少数民族。然而，克隆筛选方法的改变或高通量测序的深度不够，这些微生物的差异可以忽略不计。分析了393个功能基因土壤微生物组成及功能基因多样性。在热带雨林中发现了与碳、氮、磷循环有关的功能基因。包括相关微生物基因在内的碳循环相关基因是简单和困难的底物，典型对应分析和多元回归树分析结果表明，不同地区土壤速效氮含量与土壤微生物功能基因组存在显著差异，代谢势与土壤有效氮含量之间存在显著相关性[1]。

1.3 高通量测序

该测序已应用数十年，测序质量高，序列长度可达750～1000bp。这种方法不能测量混合序列，因此有必要构建克隆库。将目标序列转移到宿主细胞（一般为大肠杆菌）培养基中形成单一菌株，然后对目标序列进行测序，在环境样品中微生物多样性高，耗时长，成本高。

在过去的十年里，测序方法有了很大的改进。Sanger 测序法是基于同一核苷酸的四种不同颜色而无荧光的方法。当DNA 聚合酶合成互补链时，每次核苷酸加成都会释放出相应的荧光，捕获到的荧光信号通过专门的计算机软件进行处理，得到被测DNA 的序列信息。换句话说，合成测序也被称为第二代测序。对目的基因的PCR 产物进行测序。一个反应产生数万到数百万个序列，大大增加了测序的广度和深度。Miseq/hiseq 测序是两种高通量测序方法，通过在每个样本上标记引物来识别不同的样本序列。它可以同时分析多个环境样本，获得大量的序列。芯片样品定量PCR 可同时扩增2304个PCR产物，并可在一个反应中同时完成序列库PCR。PCR 产物可直接用于第二代测序分析，结合第二代测序5h 后才能获得微生物群落组成和丰度信息，简化了第二代测序样品的制备过程。目前，454焦磷酸测序仍在许多研究中使用[2]。

2 环境微生物的功能性质和基因表达分析

除了了解生物多样性和群落组成外，通常还需要分析这些微生物的功能特性，例如：它们的兼容性和功能性，以及它们与生态系统能量和营养流的相互作用。广泛使用的微生物功能分析方法包括可持续同位素。将微生物DNA 或RNA与功能基质、微生物基因组学和宏观分析相结合的标记，以及确定微生物对象类型和功能的单细胞研究方法。

2.1 同位素标记与核酸相结合

稳定同位素标记结合DNA，或在水、土壤、沉积物和其他生态系统中发现微生物的类型和功能，一直是微生物生态学研究的主要目的。近二十年来，环境微生物在种类和功能方面取得了很大的成就，但这是一个薄弱环节。稳定同位素和放射性同位素技术是微生物生态学的重要进展。它将微生物物种与生物技术联系起来。稳定同位素剖面（SIP）使用稳定的同位素基质（如C、N 等）。微生物标记物（DNA、RNA、蛋白质、磷脂脂肪）使用这些亚基类（PLFA）标记物用于鉴定活跃环境中的微生物及其在群落水平上的相互作用[3]。

以“同位素标记空气中的二氧化碳”为水稻根际标记，分析了根际土壤根系分泌物的代谢活性，发现根际土壤中的水稻集群，说明该古生菌在植物分泌物或残渣产甲烷过程中起着重要作用。用C-甲苯标记物分析海洋沉积物表明，重DNA模块比轻RNA 成分更重要。理论上，485bp 的c-DNA 酶片段占优势，属于脱硫单胞菌。除Ⅱ型苄基还原酶外，还有Ⅱ型苯并可追溯酶，已鉴定出各种厌氧电子受体的遗传密码和相关的最终氧化酶基因，表明该菌株具有代谢潜力。

2.2 基因组学和转录

从已知生物体中提取的微生物基因组学和转录组DNA 或RNA 不需要在目标片段中添加PCR 扩散和序列，以获得数百个随机中断片段的完整遗传信息，也称为鸟枪测序。与基因组学和转录组学相比，基因组学宏观转录组学反映了整个群落的特点。基因组学不仅提供各种微生物群落的分类学数据，而且提供所有微生物的遗传信息，基因组学有两个目的：一是分析微生物群落的潜在功能，确定随机序列的短序列和基因功能的定量。其次，这些基因的功能部分可以与其他基因结合，作为分类的参考材料。一般基因持有者测量的基因与已发表或注释的基因进行比较，并直接与信息进行比较，现有参考数据库中包含的信息。实时反映微生物群落中的基因表达，包括样本中哪些生物目前处于活跃状态，RNA 在微生物细胞和土壤样本中保存的DNA 少得多。因此，从环境样本中提取RNA 理论上是生物基因表达的一种图像。在目前的模型中，人们往往通过深入的宏观经济研究来了解复杂微生物的动态。

2.3 细胞水平研究

与DNA 或RNA 结合，以识别微生物物种和成分。群落水平中微生物种类和组分的功能是相关的，但单细胞微生物的代谢活性水平与不同微生物细胞的代谢活性水平不同，改进的单细胞成像方法、稳定同位素和放射性同位素标记以及荧光原位杂交，这是一种指示微生物数量、类型和功能的方法，以及一些微生物视觉交互图。

同位素质谱仪可以检测任何稳定的半衰期同位素。常用的生物分析方法是分析样品中的C、N、P、S、H 和卤素元素，并用来描绘复杂微生物群落中微生物细胞的代谢活动。此外，在计算细胞吸收系数时，分析了环境中元素的代谢[4]。

拉曼光谱和纳米二次离子质谱具有微米级甚至纳米级的分辨率，可以用来测定纯作物细胞或生态微生物的代谢活性，从而确定系统发育的信息。该方法主要适用于水、微生物纯培养或浓缩培养等相对简单的环境。土壤微生物研究这些方法的应用提高了对微生物种类与环境关系的认识。作为单细胞非破坏性物种，拉曼鱼在微生物生态学中的应用很少。结果表明，该根瘤为假单胞菌，对地表水有明显的吸收和同化作用，单核细胞中含有C，这表明，该方法在同时检测微生物种类和功能的同时，具有鉴定微生物细胞代谢异质性的潜力。与拉曼鱼相比，纳米鱼在微生物生态学中的应用更为广泛，在研究微生物的碳、氮和硫循环方面已被证明是有用的。研究了富营养化湖泊中的三种厌氧光合细菌以及富营养化湖泊中的氯网格细菌和染色细菌。结果表明，氮和碳分别占70%和40%。根据N2标记实验和纳米芯片分析的经验，发现这些颗粒与厌氧甲烷相吻合，可用于生物固氮，固定化的氮可以输送到非固氮、硫还原菌。这项研究不仅揭示了全球碳、氮、硫循环之间的相互作用，而且也显示了将同位素标记技术与纳米材料相结合，产生微生物生理成分和视觉过程的可能性。

3 结论与展望

微生物调控的生物地球化学过程影响生态系统功能微生物与生态因子的相互作用是必不可少的。分子生物学方法的发展和进步促进了环境微生物的研究，但不同的方法有其固有的局限性。方法的选择和应用应根据具体的研究情况而定。宏观组学，如高通量测序和单细胞水平，以及传统的方法如DGGE 和T-RFLP 研究，都在迅速发展。近年来，分析的广度、深度和分辨率都有了很大的提高，显示出前所未有的优势和应用前景。然而，这些方法也存在一些问题：①高通量测序通常产生数百个碱基或更短的序列，因此很难形成完整的基因；即使得到所有这些碱基，由于许多基因的功能尚不清楚，很难精确地从序列到功能进行映射。②细胞水平的研究方法，对同位素标记物的拉曼检测，其光谱偏差应达到10atom%；脱水和其他措施也可能影响样品制备和固化过程中微生物细胞的同位素组成。另外，由于选择和PCR 本身存在的问题，可能会对微生物产生误解。例如，生物信息学分析产生的错误序列（嵌合体）被移除，此外，获得的信息可以很容易地被PCRs 放大，增加的种群大多是优势种群。