张翰超，郭彩霞，李艳博

（首都医科大学公共卫生学院环境毒理学北京市重点实验室，北京 100069）

随着纳米技术不断进步，纳米材料因其结构和尺度特点具有卓越的导电性和反应活性等被广泛运用到化工和航天领域、计算机技术、环境能源和医学生物技术等领域。当社会各界在支持纳米材料的积极作用时，其可能对环境和人体带来的消极影响也逐渐引发关注。多年来，纳米材料在其毒性影响未认知的情况下被广泛使用，导致其不断沉降于地表、蓄积水体之中并在大气中扩散，进而通过呼吸、饮食、皮肤接触等途径暴露于人体。随着纳米毒理学研究的不断深入，人们逐渐认识到纳米材料的毒性及其作用机制。大量研究表明，氧化应激是纳米材料诱导细胞毒性作用的主要机制之一。随着纳米材料颗粒尺寸的缩小，其表面晶格可能出现破损，而出现电子缺损或更多的活性位点，一定条件下可与O2相互作用形成超氧自由基及活性氧（reactive oxygen species，ROS）。新近研究发现，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是纳米材料引发细胞毒性效应的另一重要机制。ERS可改变细胞内钙稳态，参与ROS的诱导及其引发的氧化损伤作用，最终参与调控纳米材料引发的细胞凋亡、自噬紊乱等细胞生物学过程［1-2］。

内质网是真核细胞中重要的细胞器，是细胞中蛋白质合成和折叠的主要部位，对脂质的生物生成和钙的储存、转运等起重要作用。各种细胞应激，如缺氧、氧化应激、低葡萄糖水平、病毒感染、药物或环境应激可导致未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网中积聚，这种情况被称为ERS［3］。ERS会激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）信号通路，暂停早期蛋白质的合成，减少未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网的积聚，从而使细胞恢复正常生理功能。但持续或过度的ERS则会损伤内质网稳态，最终引发细胞死亡［4］。纳米材料的暴露可引发或加重人体多种疾病，包括肺、心血管和神经系统疾病。越来越多的研究提示，ERS是神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病和肥胖等发生发展过程的重要环节。深入研究ERS及其在纳米毒理学中的作用，对于阐明纳米材料有害生物效应作用机制、发现新的生物学标志物具有重要意义。

1 内质网应激

UPR是内质网腔内未折叠或错误折叠蛋白积聚的一种适应性反应，对于修复早期或损伤较轻的细胞，维持机体生理平衡和内环境稳态起着重要作用。当稳态不能重建，内质网的UPR信号转导途径将引发细胞凋亡，清除过度损伤的细胞。内质网跨膜蛋白RNA依赖蛋白激酶样ER激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、活化转录因子 6（activating transcription factor 6，ATF6）和肌醇需要酶 1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）是ERS 的传感器，能感受内质网腔内未折叠蛋白的堆积。正常情况下，他们与ER管腔伴侣葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78；也称为BIP）结合，处于无活性状态。在ERS存在时，GRP78从这3种跨膜应激感受蛋白上解离以协助蛋白质折叠，从而激活这3个ERS传感器蛋白及各自的UPR通路。PERK是内质网Ⅰ型跨膜蛋白，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与GRP78解离后，通过自身二聚化和磷酸化而激活，且激活的PERK磷酸化真核细胞翻译起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，EIF2α），抑制蛋白质翻译合成。同PERK类似，IRE1α也是内质网Ⅰ型跨膜蛋白，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和位点特异的核酸内切酶活性。IRE1α活化是细胞处理UPR的关键。从GRP78解离后的IRE1α通过同源二聚体化和自磷酸化而激活。活化的IRE1α可剪切X盒结合蛋白 1（X-box binding protein 1，XBP1）前体mRNA，切除26 bp的内含子，编码产生有活性的转录因子 XBP1剪接体（spliced XBP1，XBP1s）。ATF6是内质网膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，从GRP78上释放的ATF6转录因子被转运到高尔基体，并通过跨膜位点1和位点2蛋白酶水解激活，转入细胞核，促进基因表达。

ERS的产生是为了调动UPR以抵御应激产生的损害，但当UPR不足以重建内质网稳态，可通过NF-κB激活炎症反应，或通过以上3个信号通路启动ERS介导的凋亡信号通路，诱导细胞凋亡［5］。ERS介导的细胞凋亡信号通路被认为是独立于线粒体途径和死亡受体途径的第3条细胞凋亡途径。其中，C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）是ERS介导的凋亡通路的重要组成部分［6］。CHOP广泛表达于哺乳动物细胞，正常情况下表达较低，ERS激活的PERK，IRE1α和ATF6均可激活CHOP，促进CHOP表达，诱导细胞凋亡［7］。如果ERS持续存在，PERK/EIF2α通路可通过增加某些转录因子（如活化转录因子ATF4）的mRNA翻译来触发细胞凋亡。ATF4调节许多与细胞存活和细胞应激反应相关的基因，可刺激CHOP翻译，从而启动凋亡并抑制抗凋亡Bcl-2家族蛋白的转录。PERK-EIF2α-ATF4是CHOP蛋白表达所必需的。人类胱天蛋白酶4与啮齿类动物胱天蛋白酶12同源，都定位于内质网膜，活化后可激活胱天蛋白酶级联反应，参与ERS介导的凋亡事件。胱天蛋白酶12可被ERS中的多种途径激活，如胞质钙活化蛋白可裂解激活胱天蛋白酶12以应答ERS导致的Ca2+向胞质外流。此外，IRE1α可通过磷酸化激活JNK，进而磷酸化Bcl-2家族蛋白，促进细胞凋亡的发生。

2 内质网应激在纳米材料毒性效应中的作用

除纳米从业人员存在较高水平暴露外，人类通过环境暴露、皮肤接触、消化道摄入和医源性暴露等途径接触纳米材料的机会也日渐增加。大量研究证明，纳米材料通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入后可广泛分布在全身多脏器系统，尤其是肝、脾、肾、肺和心等受累，引发或加重疾病过程。内质网是细胞内易受氧化应激攻击的细胞器，也参与细胞内ROS生成、蛋白质合成、转运以及Ca2+的调节。有研究发现，纳米银颗粒（silver nanoparticles，Ag-NP）、纳米氧化锌（zinc oxide NP，ZnO-NP）和纳米羟基磷灰石等NP可累积在内质网中［8-11］。而NP在内质网的蓄积会抑制内质网内蛋白质翻译，诱发ERS以抵抗内质网损伤或功能障碍。已有文献指出，ERS可能是纳米材料引发有害生物效应的早期、敏感的生物标志物［10］，但并不是所有的纳米材料均可激活细胞内ERS。低浓度ZnO-NP即可激活血管内皮细胞中UPR，但纳米氧化铈则不能。类似的是，聚合物修饰的纳米金颗粒作用于脑内皮细胞后，也未观察到ERS的发生［12］。这提示ERS响应与纳米材料自身理化特性、作用剂量、时间和细胞模型等有关，有待进一步深入探讨。

2.1 在金属纳米材料毒性效应中的作用

2.1.1 碲化镉量子点

直径在2～10 nm的半导体量子点（quantum dots，QD）是一类新型的荧光纳米材料，被广泛应用于细胞内示踪、生物医疗成像、药物载体和治疗中。有研究发现，内质网可能是碲化镉QD引发血管内皮细胞毒性的重要靶细胞器［13］。低浓度（0.1和1.0 mg·L-1）作用下，碲化镉QD导致人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中内质网发生扩张，且ERS标志分子GRP78和GRP94表达升高；在高浓度（100 mg·L-1）作用下，细胞则出现严重的ERS，PERK/EIF2α/ATF4依赖的ERS信号通路被激活，且ATF4绕过EIF2α磷酸化引起的翻译抑制，导致凋亡基因如CHOP、胱天蛋白酶12和JNK被激活，最终造成ERS介导的细胞凋亡发生。该作者认为，较低剂量碲化镉QD作用时出现的ERS可认为是对最终细胞损害结果的警告。

2.1.2 纳米氧化锌颗粒

ZnO-NP被广泛应用于化妆品、防晒霜、高级纺织品、自充电和电子设备中。有研究发现，ZnO-NP可通过氧化应激造成肝损伤，诱导肝细胞凋亡［14-15］。ERS参与多种外源性化合物诱导的肝损伤。有研究者报道，小鼠灌胃（ig）ZnO-NP（每天0.2或0.4 mg·g-1，连续90 d）后，肝出现局灶性肝细胞坏死、中央静脉充血扩张，并伴随显著的肝功能改变；透射电镜观察可见肝细胞内质网肿胀、核糖体脱颗粒，且肝组织中GRP78、GRP94、XBP1和蛋白二硫键异构酶3（protein disulfide isomerase，PDI-3）mRNA表达以及PERK和eIF2α磷酸化均呈剂量依赖性增加［16］，表明ig给予ZnO-NP诱导小鼠肝细胞出现ERS。同时，暴露于ZnO-NP可显著增加肝组织中ERS相关的凋亡调控蛋白表达，包括JNK磷酸化、CHOP和胱天蛋白酶3，9和12的活性，表明ERS可能介导ZnO-NP诱导的肝细胞凋亡。除在肝细胞中通过UPR通路诱发ERS外，ZnO-NP在其他细胞中也有类似结果发生。CHEN等［10］研究显示，ZnO-NP通过PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路激活HUVEC或中国仓鼠卵巢细胞内ERS反应。而且低浓度ZnO-NP（120 μmol·L-1，24 h）对HUVEC无细胞毒性效应，但已可激活ERS反应，表现为XBP1s和CHOP mRNA表达增高，且抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸预处理可彻底遏制此效应，说明ROS参与ERS的发生；浓度提高至240 μmol·L-1时出现细胞凋亡，且检测到活化的胱天蛋白酶12高表达。另外，ZnO-NP诱导ERS与其粒径有关，较90 nm ZnO-NP相比，30 nm ZnO-NP诱导的ERS更显著，小鼠肝细胞凋亡更严重［17］。

2.1.3 纳米银颗粒

Ag-NP在医学产品中的应用，增加了其潜在的人体暴露机会。有研究发现，Ag-NP（120 nm）浓度低至0.1 mg·L-1即可诱导斑马鱼胚胎和人肝细胞发生ERS［18］。线粒体钙超载和内质网钙库流失参与ERS介导的细胞凋亡。ZHANG等［19］的研究显示，人肝细胞和仓鼠肺成纤维细胞暴露于Ag-NP后，细胞内线粒体钙水平升高，内质网荧光强度显著升高；Ag-NP诱导GRP78释放，PERK/EIF2α磷酸化、IRE1磷酸化和ATF6剪切，导致ERS发生，并呈现时间依赖效应；而且，沉默PERK，IRE1或ATF6的表达可抑制Ag-NP诱导的ERS，下调CHOP表达可减弱Ag-NP诱导的细胞凋亡。还有研究发现，小鼠经气管内滴注染毒Ag-NP（0.1或0.5 μg·g-1）后，肺、肝和肾显示出显著的ERS应答，但仅肺和肾检测到细胞凋亡发生；血管和气管则仅发现轻微的ERS和细胞凋亡现象［20］。新近研究还发现，颗粒粒径大小、表面积和生物冠的形成控制着Ag-NP作用下ERS的诱导［21］。

2.1.4 其他金属纳米材料

其他金属纳米材料（如纳米金颗粒）也可通过激活3种ER传感器（PERK，IRE1和ATF-6）诱导ERS介导的细胞死亡［22］；同样，氧化镍NP可激活ERS介导的肝细胞凋亡［23］。还有研究显示，二氧化钛NP的毒性依赖于钛含量和颗粒形状，其对细胞内钙稳态产生影响，从而导致ERS［24］。

2.2 在非金属纳米材料毒性中的作用

2.2.1 纳米二氧化硅颗粒

二氧化硅NP（silicon dioxide，SiO2-NP）是世界上生产量较多的一种纳米材料，其在生物医药领域的应用越来越受到关注，但随之而来的生物安全性问题不容忽视。早期有研究发现，无表面修饰和银包被的SiO2-NP均可提高哺乳动物细胞内ERS重要标志分子GRP78和GRP94的水平［25］。新近研究发现，ERS在SiO2-NP诱导血管内皮细胞功能紊乱和细胞凋亡中发挥重要作用。SiO2-NP可诱导HUVEC细胞内3条UPR通路活化，并激活CHOP、胱天蛋白酶12和JNK的表达，通过ERS途径介导细胞凋亡［8，26］。而且，大鼠经气管内滴注 SiO2-NP后，其血管组织中GRP78和CHOP表达也显著升高，且内皮细胞凋亡增加［8］。同样SiO2-NP还可激活人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）［27］和人肝癌细胞（Huh7）［28］等发生ERS，导致细胞凋亡发生。值得一提的是，SiO2-NP诱导ERS的能力与其结构、粒径等密切相关。如20 nm SiO2-NP以剂量依赖的方式诱导内皮细胞活力降低，且GRP78和IRE1α的表达显著增加，但同等条件下其他粒径SiO2-NP（30，40和50 nm）处理的内皮细胞则无此作用［29］。而且，20 nm SiO2-NP诱导内皮细胞经不同机制发生凋亡和坏死，前者由ROS调控的ERS依赖性方式引起，后者则通过细胞自噬介导坏死性细胞死亡。

2.2.2 碳纳米管

碳纳米管（carbon nanotubes，CNT）是管状纳米级石墨晶体，可分为多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNT）和单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotubes，SWCNT）。无论是SWCNT，还是MWCNT，均可诱导ERS。如有研究发现，暴露于SWCNT中，细胞凋亡、自噬相关蛋白和ERS相关蛋白的水平明显增加；TEM图像显示，SWCNT诱导ER扩张、自噬泡形成以及细胞膜消失，导致细胞器分离［30］。还有研究利用3种MWCNT，即XFM4，XFM22 和 XFM34（粒 径 XFM4＜XFM22＜XFM34），以了解粒径对MWCNT毒性作用的影响。在相同质量浓度作用下，XFM4较其他2种MWCNT诱导更高水平的细胞毒性，更易被HUVEC摄取。而且，仅XFM4诱导了ERS反应明显发生，表明MWCNT的粒径影响其诱导ERS能力及细胞毒性效应［31］。

3 结语

综上所述，纳米材料被细胞摄取及其在内质网中的积累，打破内质网稳态，导致细胞内ERS快速激活，以恢复内质网稳态，但延长ERS会导致细胞不良结局。ERS是纳米材料诱导细胞凋亡的重要机制，目前已发现3条ERS诱导的细胞凋亡途径，即PERK-eIF2α-ATF4-CHOP和JNK通路活化以及胱天蛋白酶12的激活。ERS还参与纳米材料诱导炎症反应和焦亡等［32］。重要的是，ERS与线粒体、溶酶体和氧化应激等存在交互作用。ERS可通过调控钙转运引发线粒体功能障碍［33］。Ag-NP处理的人神经母细胞瘤细胞中内质网和线粒体紧密接触的膜长度明显增加［34］。SiO2-NP导致人胶质母细胞瘤发生线粒体功能失调，同时激活ERS和炎症［35］。在SiO2-NP诱导的血管内皮细胞凋亡［26］、二氧化钛NP诱导睾丸支持细胞凋亡［36］过程中均有线粒体-内质网途径的共同参与。此外，纳米材料还通过激活内质网自噬来维持内质网稳态。SiO2-NP处理的人结肠癌细胞中，自噬泡、内质网和溶酶体发生共定位［37］。调节ERS有可能成为疾病治疗的新策略。有研究发现，与乳腺癌细胞MCF-7和T-47D相比，非癌性MCF-10A细胞对Ag-NP更具抗性。Ag-NP可引发乳腺癌细胞内ER传感器快速响应，最终诱导肿瘤细胞凋亡［38］。不过，纳米材料理化性质（结构、类型、粒径等）不同，ERS在其诱导细胞死亡中的作用程度也不尽相同。即便是同一种纳米材料，其细胞生物效应也受细胞模型、作用方式、实验模式等影响。因此，仍需继续研究来更好地阐释ERS在纳米材料毒性效应中的作用及机制，更好地指导纳米材料的安全生产和使用，更好地开发纳米材料在生物医药领域的应用潜力。