王洛萱，李劲草，张有志

（军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

国际睡眠障碍分类第三版将失眠症定义为在睡眠时间充足，环境适宜的条件下发生入睡或睡眠维持困难，并导致日间功能障碍的神经精神疾病［1］，以入睡困难、频繁觉醒、早醒和非恢复性睡眠为主要症状。失眠症是最常见的睡眠障碍，短期失眠发生率可达30%～50%，世界主要工业国中，慢性失眠患者至少占总人口的5%～10%，有5%～7%的人曾经或正在使用处方药治疗失眠［1］。针对我国一般人群的流行病学调查表明，15%受慢性失眠困扰［2］。失眠可增加糖尿病、冠心病、哮喘、肥胖症、抑郁症、焦虑症和创伤后应激障碍（post-traumatic stress disorder，PTSD）的患病风险［3］，严重影响患者的身心健康和生活质量，同时也给社会造成沉重负担，据估计在美国失眠症每年造成20亿～160亿美元的直接经济损失［1］。

针对失眠症的治疗措施主要包括改善睡眠卫生习惯、认知-行为疗法和药物治疗，以药物治疗最为便捷有效，但目前常用的镇静催眠药物存在不同程度的副作用和用药安全问题［1］，失眠治疗需要安全有效的新型镇静催眠药物。对于失眠症的神经生物基础研究和新型镇静催眠药物的临床前评价需以建立适当的动物模型为基础，模式生物多选择大鼠、小鼠等啮齿类动物。候选药物的镇静催眠作用常以能延长戊巴比妥钠所致小鼠翻正反射消失时间为评价指标［4］，也可参考动物自发活动情况进行判断，但仍需以脑电结合肌电分析作为评价睡眠时间和睡眠结构的金标准。与人类相似，啮齿类动物的脑电图形由α，β，θ和δ 4种特征性波形组成，其睡眠过程可根据脑电和肌电特征分为非快速眼动（non-rapid eye movement，NREM）睡眠和快速眼动（rapid eye movement，REM）睡眠2种时相。NREM睡眠脑电特征以δ波为主，期间睡眠深度持续增加、无肌电活动，是睡眠产生恢复作用的主要时期；REM睡眠常伴有阵发性肌电活动，脑电活动以θ波为主，2种时相在睡眠过程中的时间分配和各频率脑波所占比例也是评价睡眠水平的重要指标。

本文对目前常用动物失眠模型进行梳理，突出不同造模方法对动物睡眠结构和脑电特征的影响，以期为失眠症及镇静催眠药物的实验研究提供参考。

1 应激失眠模型

应激使下丘脑-垂体-肾上腺轴功能亢进，产生的生理唤醒状态可抑制睡眠。应激源包括条件性应激源和非条件性应激源（如限制活动和轻度电击），对睡眠的影响因其性质、强度、作用时间和个体敏感性而异。一般而言，短暂温和的应激导致REM睡眠增加；而长时间较强应激则严重扰乱睡眠节律，产生类似失眠的状态。将大鼠暴露于应激环境中，数小时后出现睡眠潜伏期延长、睡眠时间缩短、频繁觉醒和睡眠碎片化，与应激所致失眠的临床特征相似［5］。

1.1 心理应激

心理应激模型在多种疾病的研究中应用广泛，使用心理应激造模方法在睡眠研究中构建动物失眠模型也多见报道，其中束缚应激是研究和使用较多的一种。束缚过程中，应激因素持续存在，睡眠基本被完全剥夺。大鼠或小鼠经历短时间束缚（1～2 h）恢复自由活动后，可出现持续数小时的反跳性睡眠增加，表现为NREM睡眠中低频脑波活动增加和REM睡眠时间延长［6］。长时间慢性束缚应激可使模型动物睡眠时间减少，睡眠结构改变，出现失眠样表现。王智等［7］在研究中使用束缚管对大鼠进行造模，连续14 d，每天束缚6 h，大鼠表现为总睡眠时间减少，浅睡占比增加，NREM和REM睡眠比例降低。

1.2 陌生睡眠环境

陌生睡眠环境可影响睡眠的时间和质量，这一现象常出现在长途旅行或倒班工作的人群中，可称为“首夜效应”或“第一晚效应”，在早期的睡眠临床研究中，也观察到研究对象在陌生的实验环境中睡眠受到影响［8］。基于这一效应，可构建简单有效的动物失眠模型，如在笼具中引入新物体、改变饲养房间环境或更换饲养笼具均可导致大鼠（或小鼠）立刻出现睡眠潜伏期延长及NREM和REM睡眠同时减少［9］。刘正［4］采用更换笼具的方法建立“第一晚效应”小鼠失眠模型，并对其睡眠特征进行评价。结果表明，更换笼具后，小鼠觉醒时间显著增加，睡眠时间减少，睡眠维持困难，碎片化程度增加，伴有NREM睡眠强度代偿性增加。TANG等［10］的研究表明，除对睡眠和觉醒时间影响外，更换笼具和新物体引入同时改变了模型动物的睡眠脑电特征，主要表现为NREM睡眠过程中慢波活动增加。GAMBLE等［11］对上述方法进行改良，将大鼠连续暴露于2组不同的陌生笼具中（分别由其他大鼠使用7 d），单次暴露时间3 h，该法能更有效地干扰模型大鼠睡眠，并导致记忆力受损。模型大鼠觉醒时间和睡眠潜伏期增加，NREM和REM睡眠时间减少，上述失眠表现在初次更换笼具后的3 h内更为明显。

1.3 创伤后应激障碍

PTSD是一种由于受到威胁性或灾难性心理创伤而延迟出现或持续存在的精神障碍，睡眠障碍（频繁觉醒、噩梦和NREM睡眠减少）是PTSD患者主要症状之一［12］。许多用于PTSD研究的动物模型同样可作为失眠模型。此类模型多采用条件性恐惧法建立，将负性刺激（如足底电击）与中性提示（如声音、光照或特定物体）或特定环境（如实验房间）进行关联。造模成功后，条件性恐惧提示即可诱发动物的恐惧和焦虑样行为［13］。SHARMA等［12］使用天敌气味作为负性刺激，特定笼具作为提示环境建立小鼠PTSD模型，每天将小鼠置于特定笼具中30 min后，加入使用过的猫砂暴露90 min，进行恐惧记忆训练。5 d后在无气味的笼具中进行睡眠分析。模型小鼠出现过度觉醒（觉醒时间增加，觉醒期间脑电θ波和γ波比例增加）、睡眠质量降低（NREM睡眠减少，NREM睡眠中δ波比例降低，β波比例升高）和睡眠节律紊乱（夜间睡眠时间增加），模拟了PTSD患者的睡眠障碍。

1.4 水面平台

水面平台法是经典的睡眠剥夺方法，最初以猫为模型动物，后应用于啮齿类［14］。该实验的设计初衷是选择性剥夺REM睡眠，经过改良后，目前常用的方法是将大鼠或小鼠置于略高于水面的小平台上（常用直径为大鼠6.5 cm，小鼠2.4 cm），REM睡眠时肌肉张力的丧失使动物接触水面或落水而被唤醒，REM睡眠被选择性剥夺。对照动物放置在一个更大的平台上，并在水面上放置铁网，允许快速眼动睡眠发生，同时排除隔离、活动限制和潮湿环境等应激因素造成的影响［15-16］。由于造模过程中REM睡眠剥夺和其他应激因素的积累，动物返回饲养环境后可出现短时间睡眠障碍，伴有活动亢进、躁动不安和攻击性增强等应激行为［17］。

1.5 慢性不可预知应激

长期、反复出现的日常压力是抑郁症和慢性失眠的重要诱因。抑郁症和失眠之间存在密切关联，抑郁症患者常出现频繁觉醒（碎片化睡眠），NREM睡眠中δ波减少和REM睡眠时间增加［18］。慢性不可预知应激模型最初由KATZ等［19］以大鼠为模型动物建立，通过反复、随机施加禁食、禁水、夹尾、强迫游泳、潮湿垫料和电击等应激因素使动物出现抑郁样行为，同时具有睡眠碎片化、深睡眠减少和REM睡眠增加的失眠表现［20］。NOLLET等［21］采用该方法建立小鼠慢性应激模型，应激因素包括倾斜笼具、潮湿垫料、天敌气味、无垫料饲养、水环境饲养和活动限制等，造模时间为9周，从睡眠、一般状态、行为和内分泌等多个角度选择了46个指标对模型动物进行评价。结果表明，REM睡眠、皮质酮分泌和皮毛状态等指标对慢性应激最为敏感。模型动物的睡眠改变主要表现为REM睡眠时间和睡眠总时间显著增加，但NREM睡眠片段数量增加，持续时间缩短，提示睡眠呈现碎片化趋势，睡眠深度降低。

2 特殊环境失眠模型

大脑接收的环境信息可对睡眠的发生和维持产生重要影响，环境中的声音、气味、温度和氧含量异常均可导致睡眠障碍。

2.1 噪声暴露

人类睡眠对声音刺激非常敏感，同样，在动物实验中，将大鼠暴露于环境噪声或人工合成的宽频噪声中可显著减少其NREM和REM睡眠［22］。睡眠剥夺的噪声强度一般为85～90 dB，为避免动物对噪声产生适应，所用声音多为不同性质、强度和频率的噪声的随机组合，可包括交通噪声、警报、音乐和人工合成噪声等［23］。长期暴露于噪声环境可对睡眠造成永久性影响，暴露于环境噪声9 d后，大鼠NREM睡眠和REM睡眠长期维持在较低水平，睡眠碎片化程度增加［24-25］。另一项研究发现，大鼠噪声暴露36 d后，睡眠结构发生改变，NREM睡眠比例降低而REM睡眠比例升高［23］。

2.2 低温暴露

体温调节对睡眠和觉醒状态的维持同样发挥重要作用，总体而言，低温环境中啮齿类动物睡眠减少，觉醒增加，而高温环境则促进睡眠，本文主要讨论低温对睡眠的影响。大鼠暴露于低温（-10～10℃）环境中24～48 h，觉醒时间显著增加，NREM睡眠时间减少，REM睡眠被大幅抑制［26］。低温对2种睡眠时相的影响并不一致，REM睡眠时间与环境温度压力呈负相关，而低温对NREM睡眠的影响主要表现为δ波功率降低，提示低温主要影响NREM睡眠的深度，而非持续时间［26］。低温同样抑制小鼠睡眠，增加觉醒。SATO等［27］研究表明，与对照组（环境温度27℃）相比，低温暴露组（环境温度20℃）小鼠在夜间的睡眠总时间、NREM睡眠时间和REM睡眠时间均下降，而2种睡眠时相的片段数量和片段平均时长未受显著影响。

2.3 低压低氧暴露

高原低压低氧特殊环境常导致睡眠障碍，是高原病的主要表现之一，初次进入高原地区人群的失眠发生率＞30%［28］，主要特点为睡眠维持困难、睡眠中呼吸暂停、周期性呼吸和多梦等。在实验室模拟的低压低氧环境中也可诱导大鼠失眠，ROY等［29］使用动物低压氧仓模拟约海拔7600 m环境（气压37.6 kPa，氧分压7.9 kPa），大鼠暴露7或14 d后，在常压常氧条件下进行12 h睡眠分析。结果表明，2组大鼠均出现睡眠总时间减少，觉醒时间和睡眠潜伏期增加，在睡眠结构上都表现为深睡眠和REM睡眠占比下降，浅睡眠比例增加。另一项研究使用无线生理信号采集技术对大鼠睡眠进行分析，在模拟的海拔7620 m环境中，大鼠睡眠总时间、NREM睡眠时间和REM睡眠时间均明显缩短，觉醒时间增加［30］。

3 药物失眠模型

睡眠的调节涉及多种神经递质系统，主要的促醒核团包括5-羟色胺能中缝核、脑桥被盖核、去甲肾上腺素能蓝斑核、组胺能结节状核和多巴胺能腹侧被盖区。作用于这些系统的药物可影响睡眠时间和睡眠结构，用于模拟失眠症的某些特征。

3.1 咖啡因

腺苷是脑内重要的抑制性神经递质，腺苷的积累是睡眠压力形成的主要原因。咖啡因是腺苷受体拮抗剂，通过结合腺苷A2A受体抑制睡眠，增强觉醒。咖啡因在人和啮齿类动物中均可导致睡眠潜伏期延长，睡眠时间减少和睡眠效率降低，能简单有效地模拟失眠症入睡困难的症状［31］。研究表明，大鼠ig给予咖啡因（3，10和30 mg·kg-1）后，睡眠潜伏期显著延长，NREM睡眠减少，觉醒次数增加，高剂量咖啡因能够同时减少REM睡眠，NREM和REM睡眠片段平均持续时间缩短，片段数量无明显变化，给药6 h后睡眠结构恢复正常［32］。咖啡因（10 mg·kg-1）同样能引起小鼠睡眠障碍，表现为觉醒时间增加，睡眠总时间、NREM睡眠时间和REM睡眠时间减少［33］。

3.2 对氯苯丙氨酸（parachlorophenylalanine，PCPA）

PCPA可选择性地作用于色氨酸羟化酶，阻碍5-羟色胺合成，ip给予PCPA可引起啮齿类动物严重失眠，由于其操作简单，效果明确，在研究中应用比较广泛。PCPA造模常用剂量为每日300～400 mg·kg-1，连续给药3 d，末次给药12 h后进行戊巴比妥钠协同催眠实验，以入睡潜伏期延长和睡眠持续时间缩短为造模成功标志，模型动物可出现毛发变黄、食量减少、易惊觉、体质量变轻等行为和一般状态改变［34-35］。

3.3 酒精暴露与戒断

睡眠障碍在酒精依赖症患者中普遍存在，在戒断期也可出现，这一现象同样存在于啮齿类动物中。研究表明，急性酒精暴露可导致大鼠睡眠潜伏期缩短，NREM睡眠时间增加和REM睡眠时间缩短，此效应具有剂量依赖性。长期酒精暴露（3～6周）对大鼠NREM睡眠无显著影响，但可降低δ，θ和β频段的脑电波功率［36］。

酒精戒断可导致一过性睡眠减少和觉醒增加，在小鼠模型中，长期反复酒精暴露和戒断导致睡眠总时间被大幅抑制，出现NREM睡眠减少，REM睡眠增加等睡眠结构紊乱［37］。SANCHEZ-ALAVEZ等［38］使用酒精蒸气吸入法构建大鼠酒精暴露与戒断模型，将大鼠饲养于密闭舱室内，每天08∶00 pm-10∶00 pm向舱内注入95%酒精蒸气，持续8周，期间大鼠平均血液酒精浓度为（182.3±6.9）mg·dL-1。造模完成后24 h进行睡眠脑电分析，模型组大鼠觉醒显著增加，睡眠碎片化程度增强（NREM和REM睡眠片段持续时间缩短，脑电频率升高），睡眠过程中θ和β波频率升高。

4 展望

大鼠、小鼠等啮齿类动物的睡眠特征与人类存在天然的差异，因此动物模型只能部分模拟人类失眠的特征。但在睡眠稳态调节、对内源性和环境因素的敏感性以及对促醒和催眠药物的反应等方面，人类与啮齿类动物的睡眠有很多相似之处，这是使用动物模型进行失眠研究的前提［39］。

针对失眠机制研究和镇静催眠药物评价而构建的动物失眠模型数量有限，因此本文纳入了其他可导致动物睡眠障碍或睡眠剥夺的实验方法，基于这些方法构建的动物模型可模拟失眠症的某些特征，部分模型可用于评价镇静催眠药物的疗效和作用特点，如束缚应激、PTSD、“第一晚效应”和水面平台等方法建立的失眠模型均有用于药物镇静催眠作用评价的研究。

理想的动物模型应能模拟失眠的主要症状，且对阳性药敏感，能在用药剂量、作用特点和副作用等方面为候选药物的临床应用提供参考。用于构建模型的实验方法应尽可能简单、高效、安全，符合动物实验伦理。构建动物失眠模型面临的主要问题是如何使模型动物在睡眠时间充足、环境适宜的条件下出现睡眠时间和质量的下降。在多数睡眠剥夺模型中，如强迫游泳、跑台睡眠剥夺等，实验动物睡眠压力持续积累，而睡眠被人为限制，在睡眠剥夺因素消失后可出现睡眠反弹。此类模型无法评价药物对睡眠的直接影响，但可用于研究药物对睡眠剥夺所致生物节律、肠道菌群或能量代谢等各方面异常的改善作用。本文涉及的失眠动物模型均有一定的局限性，任何单一动物模型都无法完全模拟失眠症的所有特征。因此，需在研究中综合运用多种造模方法构建失眠模型，同时重视对动物行为和一般状态的观察分析，尽可能完整再现失眠症的临床表现，建立多种分析指标，综合评价候选药物的作用特点。