陆达锴 张祥宝 康骋 汪际云 胡宝华

中国科学院大学宁波华美医院耳鼻咽喉科（宁波315000）

鼓膜穿孔是临床上常见疾病，中耳感染是造成穿孔的最主要原因，其次为外伤性，医源性，这些损伤可导致听力下降及耳道流脓反复感染[1]。根据穿孔的持续时间是否超过三个月可分为急性和慢性。急性期外伤性穿孔经过合理治疗后多可自愈，若穿孔长期不愈合，则可考虑行鼓室成形术以恢复鼓膜功能[2]。

鼓膜成形术是改善听力及防止中耳感染的手术，虽然现在应用传统材料进行鼓室成形术成功率也很高，但要做二次切口，且取材部位可能出现感染，变形等风险，二次手术患者存在取材局限性，所以我们要寻找一种无需手术切口，安全性高且价格适中的新型材料。而组织工程通过构建合适的支架，引入生长因子及细胞可合成新的鼓膜修补材料，或许可以帮助我们实现这一目标。

1 传统治疗鼓膜穿孔的移植材料

从组织学来说，鼓膜穿孔是由于上皮层的生长超过纤维层的生长速度，越过纤维层与黏膜层相连，形成永久性穿孔，这就需要手术干预恢复鼓膜功能。目前临床常用的材料主要有颞肌筋膜、脂肪组织、耳屏软骨膜、耳屏软骨、乳突鼓膜、静脉[3-6]等，每种材料均取自于自体，有良好的生物相容性。

目前颞肌筋膜是最常用且疗效较好的移植物，具有取材方便，柔韧性好的特点可以与鼓膜穿孔缘较好贴附，且厚度类似于鼓膜。然而，也有研究认为在咽鼓管功能障碍，粘连性中耳炎，全部或次全穿孔的情况下，颞肌筋膜不如软骨-软骨膜[7]，应用自体脂肪修补鼓膜也是近几年常用的移植物之一，报道认为应用脂肪组织材料，对鼓膜小穿孔的修补成功率在76-100%之间[5]，且脂肪组织容易获得，不良反应低，成功率也与颞肌筋膜无异[8]。另外，脂肪移植物分泌血管生成和生长因子，促进新生血管形成和组织修复，从而增加鼓膜穿孔周围的血液供应[9]。软骨-软骨膜复合物作为一种移植材料提倡在复杂的穿孔中使用，例如完全性、次全的穿孔、粘连性中耳炎、复发的穿孔以及咽鼓管功能障碍。

2 组织工程材料

近年来组织工程发展迅速，在组织工程鼓膜再生方面有巨大的潜力。组织工程材料一般包括支架材料、生物因子以及细胞。支架材料为细胞提供机械支撑，还维持细胞表型、提供细胞生长空间、促进细胞基质分泌，生长因子可以促进细胞增殖、分化、表型稳定和血管增生。因此可以通过建立合适的支撑支架，引入生长因子，以提高细胞对支架材料的黏附能力，形成用于修补鼓膜的组织工程材料[10，11]。

2.1 支架材料

鼓膜本身具有再生能力，但由于穿孔后上皮下没有支撑架构，且上皮组织生长快于纤维层，使上皮层与黏膜层相连，造成永久性穿孔。因此需要寻找一种支架或移植物作为支持，以促进细胞和营养物质向穿孔处迁移。组织工程正致力于大量新材料的研究，理想的支架应具有一定的体内可降解、良好的组织相容性、无细胞毒性和良好的机械性能，但还没有一种符合所有这些标准的材料。目前研究的支架材料主要有脱细胞组织和聚合物。

脱细胞组织是在移植物或异种移植物完全去除细胞后获得，它保留了天然组织的基本组织结构和生化成分，且不会对异体组织移植所产生的特异性细胞免疫反应，亦不会诱发非特异性异物反应[12]。移植后可作为上皮细胞、成纤维细胞移行、新生血管形成的一个良好支架，具有良好生物和结构相容性。Lee JM[13]和Min J[14]均比较人脱细胞真皮和软骨膜作为移植物，对鼓室成形术的影响，认为人脱细胞真皮可以有效替代软骨膜，两者具备的移植成功率和术后听力检测结果无明显差异，且前者能明显缩短手术时间。但由于脱细胞组织需要从尸体或其他物种中提取,当中涉及的医学伦理学和生物安全问题对其应用会有所限制[10]。

聚合物与上述支架相比具有许多优点，它们的形状，尺寸和多孔性可以根据要求可以更改。此外，它们具有生物相容性，生物降解性，易于合成和处理，可以大规模生产，并且可以控制它们的降解性和机械性能。目前研究的主要聚合物有明胶海绵[15]、乳胶赖氨酸聚合物、丝素蛋白、壳聚糖、海藻酸钙、透明质酸等。Huang P[16]应用明胶海绵贴补法观察了创伤性鼓膜穿孔的修复情况，认为明胶海绵修补不仅起到上皮移植的支架作用，还促进边缘肉芽组织的水肿和增生，促进血管生成，并加速鼓膜愈合。Jin ZH[17]等观察了引入FGF-2用明胶海绵补贴法明显缩短了鼓膜愈合时间。丝素蛋白也是一种有益鼓膜再生的材料，它是在去除家蚕丝抗原性成分丝胶蛋白后获得的，具有弹性、可降解性和生物相容性好等诸多优点。Levin B[18]置备了人鼓膜角质细胞培养在丝素支架上，观察其生长和粘附，结果认为丝素蛋白可以支持粘附，增殖和促进细胞分化。壳聚糖是天然多糖甲壳质的脱乙酰形式，其是具有抗细菌特性的粘多糖，具有无毒性、生物相容性好、可控的降解性和无免疫原性等优点。汤勇[19]将胶原和壳聚糖互补制成膜后提高了生物学性能成为较理想的生物材料，改良了壳聚糖的吸附力，利于细胞的粘附生长、迁移和增值。也有研究认为5%壳聚糖浓度的3D壳聚糖支架能使鼓膜细胞增殖，有合适的结构特征和机械性能。在体内动物研究中，鼓膜细胞能通过3D壳聚糖支架的孔隙和表面迁移，从而使鼓膜再生，3D壳聚糖支架技术可以在某些情况下用于代替鼓室成形术以愈合鼓膜穿孔[20]。海藻酸钙是一种从海藻中提取的天然聚合物，可以支持黏膜和角化上皮的生长。Weber DE应用海藻酸钙贴补大鼠慢性鼓膜穿孔，得到较好的疗效。但也有报道其潜在耳毒性风险，因此需要进一步的研究来长期评估人类安全性和有效性[21]。透明质酸广泛存在于机体的各种组织中，作为细胞间质的主要成分之一，在一项已报道的动物研究中，透明质酸刺激内源性生长因子、表皮生长因子、胰岛素生长因子、肿瘤坏死因子和血管内皮生长因子[22]。在鼓膜愈合过程中起到纤维组织再生和调节作用，这些因素促进了鼓膜愈合过程中的血运重建、细胞生长和分化。Alzahrani M[23]将脂肪移植物填入穿孔，再覆盖透明质酸膜，与穿孔缘相贴，成功率可达80%，透明质酸脂肪移植物成形术（HAFGM）可能是传统鼓膜成形术的替代治疗方法。

2.2 生长因子

生长因子可刺激组织中的伤口愈合，这些生物分子及其受体在鼓膜的再生过程中表达，通过调控组织血管生成以及细胞增殖、迁移、上皮化帮助穿孔愈合。生长因子有五大类：表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF），成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGF），血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF），转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）和胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）。关于鼓膜再生组织工程，对EGF和FGF的研究较多，这些因子可以以滴剂的形式或浸泡在支架中施用。表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）刺激DNA、RNA、蛋白质和透明质酸的合成，诱导成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞的合成，表皮生长因子的表达与修复过程正相关，这种生长因子在鼓膜损伤后自然表达，局部使用EGF在急性和慢性穿孔的动物模型中取得了良好的效果[24]。Seonwoo H[25]构建了表皮生长因子-壳聚糖片支架，壳聚糖有较好的生物相容性、机械性能、细胞黏附力、抗菌作用，EGF可以促进鼓膜残缘的上皮向中心生长迁移，提高鼓膜穿孔的愈合率，适用于鼓膜慢性穿孔。

成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGF）家族中最受关注的是重组牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），并证实bFGF是一种多肽类的细胞活素，能刺激和调节多种起源于中胚层、外胚层的细胞分化增殖，以修复鼓膜。Acharya AN[26]应用bFGF修复了小儿患者的慢性鼓膜穿孔，也取得了成功，认为或许可以微创代替传统的鼓膜成形术。但是局部应用FGF能否引发胆脂瘤还存在争议，一些研究表明FGF-2可能在鼓膜上皮诱导角质形成细胞增殖，胆脂瘤可通过固有层增生的结缔组织由表皮向内生长形成，Hakuba等[27]报道了FGF用于治疗慢性鼓膜穿孔时胆脂瘤的发生率为5%。

血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）由血小板α颗粒、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞分泌。它对成纤维细胞、平滑肌细胞和炎性细胞有强的化学吸引作用和促有丝分裂作用。有研究PDGF应用在大鼠鼓膜穿孔中，可以增加鼓膜愈合率，缩短穿孔闭合时间，具有更丰富的结缔组织纤维组织层，而应用在人体并没有提高鼓膜愈合率。

自体血清含有多种生长因子、维生素和免疫球蛋白，能够调节各种组织的增殖，促进伤口愈合,自体血清耳滴疗法在人慢性穿孔中是有效的，或许可以代替手术治疗。此外，还进行了对人脐带血清的研究，人脐带血清存在能够促进组织再生的因子，如EGF，FGF，PDGF，神经生长因子（NGF），维生素A，纤维连接蛋白，抗蛋白酶和P物质，脐带血清的NGF，EGF和TGF-β浓度比外周血清更高，因此它可能对鼓膜修复更有效[28]。

2.3 种子细胞

支架材料、生物分子和种子细胞相互作用以实现鼓膜再生。因为鼓膜有来自穿孔边缘的内源性细胞，所以大多数研究不需要使用种子细胞，只应用支架材料和生长因子促进鼓膜细胞增殖。细胞可以通过注射或整合应用到支架材料中，尽管理论上有多种细胞来源可用于鼓膜再生，但迄今为止只有少数动物研究得以实现。胚胎干细胞可以根据环境给与的信号分化成相应的细胞，Von Unge[29]使用来自小鼠的胚胎干细胞，使其成功分化成鼓膜成纤维细胞修复鼓膜。脂肪干细胞（ASC)日益成为是再生医学领域最有前景的种子细胞,与其他干细胞相比，ASC具有来源丰富、取材容易、损伤小、生物学性能稳定等独特的优势,雷蕙嘉[30]观察大鼠脂肪干细胞在聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上的生长状态、分裂增殖能力及黏附性,大鼠ASC与PLGA有较好的黏附性，可以在PLGA上正常黏附、增殖。然而，干细胞的应用可能潜在感染，致畸和肿瘤形成风险，也涉及道德和法律问题，因此在该领域的研究很少。另外有研究发现，鼓膜干细胞存在于鼓环及锤骨柄区域，这表明鼓膜本身有存在再生干细胞可能性。因此，如果残余鼓膜有其自身干细胞时，它就无需结合外部细胞以实现鼓膜修复。

3 小结

目前临床上应用最多的仍是自体材料做为鼓膜穿孔移植物，然而大部分支架材料具有良好的相容性及机械性能，能支持细胞黏附，在鼓膜穿孔的修复的研究中均取得了较好的疗效，因此，新型支架材料在未来可能代替自体材料。目前需要研究来改善生物材料，以再现与鼓膜类似的生物力学和振动特性，以及探索如何提高材料制作工艺，降低成本，推广到临床使用。生长因子可改善鼓膜穿孔的愈合，然而，在关于释放载体，生长因子类型，剂量和治疗持续时间存在争议。一些研究表明，在穿孔完全闭合之前，应持续使用这些生长因子，而另一些研究表明，单次使用就足以实现鼓膜愈合。生长因子可促进表皮和结缔组织的增殖，有报道使用生长因子可造成上皮珍珠和胆脂瘤形成，因此需要长期研究来评估其临床应用的疗效和安全性。目前对种子细胞的研究是最缺乏的，研究均是动物实验，尽管干细胞的应用获得了与鼓膜类似的新膜结构，但由于可能出现的副作用、高成本以及伦理和法律问题，其临床应用受到限制。且残余鼓膜有其自身干细胞，也没必要应用其他细胞。尽管目前组织工程材料的研究仍有不足，但随着组织工程学科的发展，将会成为一门具有巨大潜力的学科，在未来可制作出合适的生物材料代替手术治疗以修补鼓膜，且产生一定的商业价值。