范梦蝶 王天泽 杜文斌 谭 佳 梁晶晶 谢建春

（食品营养与人类健康北京高精尖创新中心 食品质量与安全北京实验室 北京工商大学 北京 100048）

山西老陈醋是我国传统名醋之一，是以高粱、大麦、豌豆等为主要原料，采用传统固态发酵法酿制，包括“蒸、酵、熏、淋、陈”5 道主要工序[1]。陈放为一个“冬捞冰、夏伏晒”的晾晒过程，陈放期一般至少1年。晾晒过程中，醋中一些物质沉淀，水分通过蒸发或结冰析出，某些物质又可充分地发生化学反应如美拉德反应等，使得酿制出的醋除具有一般醋的酸醇、味长等特点外，还兼具香、绵、不沉淀的特点[2-3]。

本文采用同时蒸馏萃取法制备样品，采用气相色谱-质谱联机、稀释法气相色谱-嗅闻（gas chromatography and olfactometry，GC-O）分析晾晒前、后山西老陈醋的关键香气活性成分及其变化，以期对山西老陈醋生产过程的控制和晾晒过程的科学化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山西老陈醋样品（晾晒前、后），山西老陈醋集团有限公司；C5-C25正构烷烃，北京化学试剂有限公司，色谱纯。

溶剂二氯甲烷、无水Na2SO4（试剂均为分析纯），国药集团北京化学试剂有限公司；香料标准品：二甲基二硫醚（＞95%）、2-甲基-3-呋喃硫醇（＞95%）、3-甲硫基丙醛 （＞97%）、3-甲硫基丙醇（98%）、二甲基三硫醚（98%）、乙酸-3-甲硫基丙酯 （95%）、甲基吡嗪 （95%）、2，6-二甲基吡嗪（95%）、2-乙基-6-甲基吡嗪（95%）、三甲基吡嗪（95%）、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪（＞95%）、四甲基吡嗪（95%）、2，5-二甲基吡嗪（95%）、2-乙基-3-甲氧基吡嗪 （＞95%）、糠醛 （98%）、5-甲基糠醛（95%）、乙酸糠酯（＞95%）、2-甲基丁醛（95%）、苯甲醛（＞98%）、苯乙醛（＞98%）、香兰素（＞98%）、异丁烯醛（＞95%）、己醛（95%）、2，3-丁二酮（95%）、乙偶姻 （＞98%）、苯乙酮 （95%）、3-甲基丁醇（95%）、苯甲醇（＞98%）、苯乙醇（95%）、α-乙基苯甲醇（＞95%）、1-辛烯-3-醇（＞98%）、乙酸（95%）、丙酸（95%）、丁酸（95%）、戊酸（95%）、3-甲基-丁酸（＞95%）、乙酸乙酯（＞98%）、γ-壬内酯（＞95%）、琥珀酸二乙酯（95%）、苯酚（95%）、愈创木酚（＞98%）、4-甲基愈创木酚（＞95%）、茴香脑（98%），美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪、7890A气相色谱仪，美国Agilent公司；气味测量仪（GC-O），美国DATU Inc公司；DF-101S 恒温加热磁力搅拌水浴锅，河南省予华仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 同时蒸馏萃取 200 mL醋样品放于500 mL圆底烧瓶中置于SDE装置的一端，120℃油浴加热，磁力搅拌。50 mL二氯甲烷置于100 mL圆底烧瓶中，置于SDE装置的另一端，45℃水浴加热，磁力搅拌。连续提取3 h。

萃取液加入无水硫酸钠干燥，Vigrex柱浓缩至2 mL，氮吹浓缩至0.5 mL。按如上进行3次平行试验。

1.3.2 气相色谱-质谱分析 采用HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）和 DB-Wax（30 m×0.25 mm×0.25 μm）两根毛细管色谱柱进行分析。起始柱温35℃，保持2 min；以3℃/min升到170℃；再以5℃/min升到250℃，保持2 min；载气为氦气，流速1.0 mL/min；进样 1 μL，分流比 10∶1。

“三新”企业具有典型的高科技、信息化特征，用工人数较少，发展规模相对较小，且大多数处于起步状态，受到行业变化、政策和竞争等影响，行业变化速度也非常快，传统的统计报表和统计方法已经不能适用于“三新”企业统计日常管理工作。

电子轰击电离源，能量70 eV；四极杆温度150℃；离子源温度230℃；全扫描模式，扫描范围33～450 amu。

1.3.3 气相色谱-嗅闻分析 由Agilent7890A气相色谱 （配有FID检测器）及嗅闻装置组成。HP-5 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），起始柱温40℃，以5℃/min升到250℃。进样口温度250℃；载气为氮气，流速1.0 mL/min；不分流。

样品用二氯甲烷按 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16……进行逐级稀释，直到嗅闻口检测不到气味时停止，每种香味化合物的最高稀释倍数为其 FD值。共3名评价员完成，通过操作软件记录嗅闻的气味特征。

1.4 化合物定性定量方法

气-质联机分析，根据NIST 14谱库、保留指数、标准品，鉴定化合物；面积归一化法定量。气相色谱-嗅闻分析，根据嗅闻的气味特征、保留指数、与气-质联机鉴定结果关联、标准品，鉴定化合物。

2 结果与分析

2.1 晾晒前后GC-MS分析结果比较

采用气-质联机从晾晒前后的山西老陈醋样品中鉴定出的化合物及含量见表1。

由表1可知，通过SDE/GC-MS分析，两种醋样中共鉴定出183种挥发性化合物，鉴定出的化合物种类包括含硫化合物 （4种）、含氮杂环（30种）、含氧杂环（24种）、醛类 （13种 ）、酮类（17种）、醇类（22种）、酸类（17种）、酯类（31种）、酚类（19种）、醚类（3种）、其它类（3种）。

由图1可知，相比之下，晒后醋中鉴定出的化合物种类数稍多，为140种，而晒前为133种，但有90种为两者共有。晾晒前，检测出酯类（25种）、含氧杂环（20种）、含氮杂环（18种）、醇类（18种）、酸类（16种）、醛类（9种）、酮类（8种）、酚类（13种）、含硫化合物（3种）、醚类（1种），其中酮类含量（30.08%）最高，其次为酸类（29.20%）、含氧杂环（15.10%）。晒后，检测出含氮杂环（28种）、酮类（17种）、酚类（17种）、含氧杂环（16种）、酸类（15种）、酯类（14种）、醇类（13种）、醛类（11种）、含硫化合物（4种）、醚类（2种），酸类含量（26.51%）最高。另外，酮类（23.5%）、含氧杂环（17.26%）、含氮杂环的含量（15.73%）也很高。

表1 山西老陈醋晾晒前后的SDE/GC-MS分析结果Table1 Results of SDE/GC-MS analysis of Shanxi aged vinegar before and after aging

（续表1）

（续表1）

（续表1）

（续表1）

（续表1）

图1 晾晒前后气-质检测出的化合物种类数和含量比较Fig.1 Comparison of number and amounts of the volatile compounds identified from the vinegars before and after aging by GC-MS

醋晒前检测出的主要化合物（含量＞1%，按两柱平均值，下同）为乙酸（26.20%）、乙偶姻（20.23%）、糠醛（13.34%）、2，3-丁二酮（7.74%）、2-羟基丙酸乙酯（4.67%）、乙酸乙酯（2.99%）、四甲基吡嗪（2.92%）、2-甲基丁醇（1.34%）、苯乙醇（1.33%）、苯基乙二醇（1.21%）、2-乙酰氧基-3-丁酮（1.16%）、2-甲基丙醇（1.08%）等12种。而醋晒后检测出的主要化合物 （含量＞1%，按两柱平均值，下同）为乙酸（21.57%）、乙偶姻（16.26%）、糠醛（14.03%）、四甲基吡嗪 （6.57%）、2，3-丁二酮（4.65%）、乙酸乙酯（3.79%）、丙酸（1.79%）、三甲基吡嗪（1.51%）、2，3-二甲基吡嗪（1.51%）、α-乙基苯甲醇（1.33%）、苯基乙二醇（1.08%）、5-甲基糠醛（1.07%）等12种。可见，晾晒后含氮杂环，醛类，酮类，酚类等化合物的种类数明显增加，而酯类化合物的种类数明显减小。

从相对含量上看，晾晒后，也是含氮杂环、含氧杂环、醛类化合物显著增加，而酸类，酮类、醇类、酯类化合物减少。其中晒后含量增加幅度较大的为四甲基吡嗪、三甲基吡嗪等含氮杂环化合物，含量降低幅度较大的为乙酸、乙偶姻、2，3-丁二酮、2-甲基丁醇等化合物。尤其在晒后醋中新检测到3-甲硫基丙醛、吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等化合物。总之，晒后醋中，含氮杂环种类和含量增加最为显著，酯类化合物种类减少最显著，酮类化合物含量减少幅度最大，酯类含量减少幅度其次。其中，四甲基吡嗪、乙酸、乙偶姻等化合物含量增加幅度最大。

2.2 晾晒前后GC-O分析结果比较

晾晒前后的醋样SDE处理，AEDA/GC-O法分析香气活性成分，所得结果见表2。

表2 老陈醋晒前晒后的GC-O分析结果比较Table2 Comparison of the results in GC-O analysis of the Shanxi aged vinegars before and after aging

（续表2）

由表2可知，两种醋中共检测出53种气味活性区，鉴定出50种气味活性化合物，包括含硫化合物（7种）、含氮杂环（7种）、含氧杂环（7种）、醛类（6种），酮类（4种）、醇类（1种）、酸类（3种）、酯类（8种）、酚类（5种）、醚类（2种）。另还有 3种气味活性区未能鉴定出。

由表2、图2可知，晒前醋中鉴定出34种气味活性化合物，包括含硫化合物5种、含氮杂环3种、含氧杂环5种、醛类4种、酮类2种、醇类1种、酸类1种、酯类7种、酚类4种、醚类2种，晒后醋中检测出39种气味活性化合物，包括含硫化合物7种、含氮杂环7种、含氧杂环5种、醛类4种、酮类4种、醇类1种、酸类3种、酯类3种、酚类4种、醚类1种。

比较晒前晒后GC-O分析结果，3-甲硫基丙醇、四甲基吡嗪、糠醛、苯乙醛、乙偶姻、乙酸、愈创木酚等23种化合物为两种醋共有，但乙酸异戊酯、乳酸乙酯、苯酚等11种化合物仅在晒前醋中检测到，而甲基吡嗪、3-乙基-2，5-二甲基吡嗪、胡椒醛、己酸等16种化合物仅在晒后醋中检测到。尤其吡嗪类化合物，晒后种类数增加，但酯类化合物种类数却下降，这与比较气-质联机分析的结果相一致。

图2 晾晒前后稀释因子较高（log2FD≥5）化合物比较Fig.2 Comparison of the aroma compounds with high FD values （log2FD≥5） in the vinegars before and after aging

稀释因子越大，对总体风味的贡献越大。由表2，晒前醋中稀释因子较高（log2FD≥5）的化合物包括乙酸、乙偶姻、2，3-丁二酮、乳酸乙酯、愈创木酚等10种，而晒后醋中稀释因子较高（log2FD≥5）的化合物包括3-甲硫基丙醇、糠醛、苯乙醛、愈创木酚等20种。晒后醋中稀释因子高的化合物种类数增多，将造成其总体香气强度增大。在稀释因子较高的化合物中，乙酸、3-甲硫基丙醛、乙偶姻、琥珀酸二乙酯、愈创木酚等为晒前晒后醋的共有物质，表明它们对晒前、晒后醋的总体香气均有重要贡献。

相比之下，晒后醋中稀释因子高的酯类、酸类、酮类化合物种类数减少，从而在总体香气中相对贡献下降，而含硫化合物、含氮杂环化合物的化合物种类数增加，从而在总体香气中的相对贡献增加。尤其晒后醋中，乙酸异戊酯、乳酸乙酯、γ-己内酯等均未检测到，而新出现甲基吡嗪，2-乙基-2，5-二甲基吡嗪等化合物。

3 讨论与结论

本文气-质谱检测到的含硫化合物为二甲基二硫醚、二甲基三硫醚、3-甲硫基丙醛和乙酸3-甲硫基丙酯，GC-O检测的含硫气味活性化合物为2-甲基-3-呋喃硫醇、3-甲硫基丙醛和乙酸3-甲硫基丙酯。3-甲硫基丙醛、二甲基二硫醚等主要贡献土豆香气和肉香气，可来源于微生物代谢发酵过程[11]，张媛媛[12]，乔敏莎[13]，江津津等[14]曾在白酒、酱油等发酵食品中检测到3-甲硫基丙醛、二甲基二硫醚的存在。但二甲基二硫醚、二甲基三硫醚晒后含量增加，很可能由于美拉德反应造成，因美拉德反应中甲硫氨酸Strecker降解可产生甲硫醇，甲硫醇氧化聚合即生成二甲基二硫醚、二甲基三硫醚[15]。

气-质谱检测到的含氮杂环化合物，无论种类数还是含量，均是晒后比晒前显著增多，这主要是由于陈化晾晒过程发生美拉德反应造成。含量显著升高的为四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪和三甲基噁唑等，其中四甲基吡嗪GC-O检测稀释因子也显著升高。四甲基吡嗪（即川芎嗪）可由发酵体系中的乙偶姻和主要由氨基酸转化而来的氨经美拉德反应生成[16]，是一种活性生物碱，是中药川穹嗪中的主要功效成分。现代医学研究证明，川芎嗪对于扩张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善脑缺血等具有很好的作用[17-18]。三甲基噁唑可由丙氨酸与2-氨基丁酸体系反应产生[19]，是醋中另一种重要的杂环化合物，且在晒后醋中含量有显著增加。苗志伟等[3]用HS-SPME萃取山西老陈醋就曾鉴定出较多的三甲基噁唑。此外，余鸣春[20]，李慧[21]等曾在镇江香醋、保宁醋等四大名醋中发现含量较高的三甲基噁唑。

气-质谱检测晒前晒后的醋中主要含氧杂环均为糠醛、5-甲基糠醛，它们GC-O检测时也具有较高的气味活性。酸性条件下戊糖或己糖发生脱水环化反应，可形成糠醛或5-甲基糠醛[22]。由于酿醋的原料是高粱，大麦和豌豆等含有淀粉的植物性原料，淀粉水解后产生糖类，因而醋酿造过程可形成大量的糠醛、5-甲基糠醛。此外，晾晒过程中，醋液中的糖和氨基酸发生美拉德反应，仍可产生糠醛、5-甲基糠醛，因而晾晒后糠醛、5-甲基糠醛含量略有上升。

气-质谱检测晒前晒后的醋中主要醛类为苯甲醛、2-甲基丁醛、苯乙醛、α-亚乙基苯乙醛，其中苯甲醛、苯乙醛GC-O检测具有较高气味活性。Xiao等[23]通过顶空固相微萃取与气-质联机分析山西苦荞麦醋的挥发性成分，也发现苯甲醛的含量较高。检测到的这些醛类物质可在发酵过程通过微生物代谢产生，也可通过美拉德反应产生。与晒前醋相比，苯甲醛和2-甲基丁醛在晒后醋中的含量有所降低，可能是由于较长时间的敞口晾晒过程中，因这些醛类物质沸点较低，有所蒸发逸失造成。α-亚乙基苯乙醛可由苯乙醛与乙醛缩合反应形成，苯乙醛可产生于美拉德反应中苯丙氨酸的Strecker降解反应，醋中含有大量的苯乙醛，因而在晒制后α-亚乙基苯乙醛含量有显著增加。

气-质谱检测晒前晒后的醋中主要酮类物质为乙偶姻、2，3-丁二酮，它们GC-O检测也具有较高的气味活性。乙偶姻是多种微生物糖代谢的中间产物，是四甲基吡嗪形成的前体物质。表1中晾晒后乙偶姻的含量降低了3.97%（晒后平均值减去晒前平均值），四甲基吡嗪相应增加，说明消耗乙偶姻从而产生功效成分四甲基吡嗪，因此开发筛选高产乙偶姻的醋酸菌菌株[24]，成为研究醋发酵的一个热点。

气-质谱检测晒前晒后的醋中主要酸类为乙酸，GC-O检测乙酸也具有较高的气味活性。乙酸主要是在酒精发酵阶段酵母菌利用糖类物质产生乙醇，而乙醇在醋酸发酵阶段中被醋酸菌分泌乙醇脱氢酶氧化成乙醛，乙醛继续氧化形成乙酸。试验表明乙酸是醋中含量最高的化合物（26.2%），晒制过程中乙酸会挥发逸失，从而导致其含量有所降低。

气-质谱检测晒前晒后的醋中主要酯类为乙酸乙酯、乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯，GC-O检测它们也具有较高的气味活性。但是酯类化合物易水解，王东新等[25]研究白酒发现，随着放置时间的延长，酯类化合物水解导致总酯含量下降。另外，由于晒制过程敞口进行且放置时间长，酯类物质也会逸失，因此晒后表现出含量下降，对总体香气的贡献程度降低。

气-质谱检测晒前晒后的醋中主要酚类为4-甲基愈创木酚、苯酚等，GC-O检测到对香气贡献程度较大的为愈创木酚，主要贡献辛香、药香。4-甲基愈创木酚主要与发酵过程植物性原料的释放及熏制工序有关[26]。通过对比气-质结果可以看出，在晒制过程中可能伴随着原料中酚类物质的继续释放，因此4-甲基愈创木酚含量增大了8倍。

虽然气-质谱从晒前晒后的醋中检测到较多醇类化合物，但这些化合物GC-O检测却未有较高气味活性。另一方面，1-辛烯-3-醇在GC-O中检测具有较高气味活性，但气-质分析并未检测到，这很可能由于1-辛烯-3-醇阈值较低造成。1-辛烯-3-醇在镇江香醋GC-O中也曾被检测到[27]。气-质检测出晒前晒后的醋中还有少量醚类化合物，它们可能来源于原料，但GC-O检测气味活性较低。

总之，晒前醋，气-质谱联机检测含量高（＞1%，按两柱平均值，下同）的为乙酸、乙偶姻、糠醛、2，3-丁二酮、乙酸乙酯、四甲基吡嗪等12种挥发性化合物，而GC-O检测稀释因子高（log2FD≥5）的为乙酸、乙偶姻、2，3-丁二酮、乳酸乙酯、愈创木酚等10种气味活性化合物。晒后醋，气-质联机检测含量高的为乙酸、乙偶姻、糠醛、四甲基吡嗪、2，3-丁二酮、乙酸乙酯、丙酸、三甲基吡嗪等12种挥发性化合物，而GC-O检测稀释因子高的为3-甲硫基丙醇、糠醛、苯乙醛、愈创木酚等20种气味活性化合物。相比之下，气-质谱联机及GC-O检测均为晾晒后一些含氮杂环化合物尤其吡嗪类化合物及含硫化合物的含量显著增加，而酯类物质显著减少。前者主要是由于陈化晾晒阶段，醋液中发生美拉德反应造成，而后者主要由于在一年四季的敞口晾晒过程中，水解和逸失造成，从而使晾晒后前者对总体的香气贡献程度升高而后者降低。