于文龙 刘卫华 章 丽 师仁丽 王向红

（河北农业大学食品科技学院 河北保定 071001）

维生素B也叫作维他命B，属于水溶性维生素，虽具有多种生物功能，但具有不稳定性[1]。B族维生素是人体不能合成的，必须通过食物或维生素制剂给予补充。烟酰胺是尼克酸的酰胺形式，是人体合成辅酶Ⅰ、二氢尿嘧啶脱氢酶和辅酶Ⅱ烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的前体物质[2]。根据研究发现：烟酰胺具有抗氧化、抗炎、代谢调控等生理功能。叶酸也称蝶酰谷氨酸，属于人体必需营养成分[3]，世界卫生组织规定成年人每日应摄入200 μg叶酸，然而，据统计，在全世界人类中叶酸摄入量还远达不到这一要求[4]。缺乏叶酸会导致多种疾病的发生，包括新生儿神经管畸形[5]、心血管疾病和癌症[6-7]等。维生素B1又名硫胺素或抗神经炎素，在自然界中通常以游离态形式存在。人体若缺乏维生素B1，会出现疲劳、精神萎靡、智力低下、头痛、浑身无力等症状[8]。维生素B2又称核黄素，日常所见的口角溃疡、唇炎、视觉疲劳等，都与维生素B2的缺乏有关。

我国相关部门发表报告指出，维生素B1、维生素B2、叶酸等微量营养素的缺乏很广泛和严重[9]。这与欠发达地区饮食结构单一相关。面粉作为欠发达地区的主要主食原料，对于面粉的营养强化添加意义重大。根据中国的面粉营养强化实行的配方，即面粉“7+1”营养素配方，营养素为钙、铁、锌、维生素B1、维生素B2、叶酸、尼克酸，维生素A[10]。其中B族维生素易受环境的影响，直接添加在面粉中，其含量会随储藏及加工逐渐损失。营养强化剂的微胶囊化尤为重要。

微胶囊化技术是指将固体、液体或气体包埋、封存在一种微型胶囊内，成为一种固体微粒产品的技术[11]。用微胶囊工艺实现包埋活性营养素，以免芯材受外界干扰，遮盖不良口感或风味，缓释芯材等目标[12]。一般将被包封物称为芯材，包封物称为壁材。通过对一些物质进行微胶囊化，可以改善产品的性质[13]。目前关于维生素的微胶囊化研究，大多数是关于脂溶性维生素，如维生素A、维生素D、维生素E等[14-15]。对于水溶性维生素的微胶囊化主要集中于维生素C[16-17]，而关于B族维生素的微胶囊化研究报道还很少。

本试验中以烟酰胺、叶酸、维生素B1、维生素B24种混合维生素为芯材，明胶与羧甲基纤维素钠为壁材，利用真空冷冻干燥技术制备复合B族维生素微胶囊，优化微胶囊的包埋工艺，并对其缓释动力学进行研究，以期为面粉中B族维生素的营养强化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂、材料与仪器

明胶、羧甲基纤维素钠（CMC），南通泰利达新材料有限公司；维生素B1、维生素B2、叶酸、烟酰胺，江西省德兴市百勤异VC钠有限公司；庚烷磺酸钠、4种B族维生素标准品，上海原叶公司；EDTA、异丙醇、三乙胺、冰醋酸、乙醇，天津天力试剂公司；甲醇，迪马公司；纯净水，娃哈哈纯净水公司；HW·SY21-K电热恒温水浴锅，北京市长风仪器有限公司；FA2004电子天平，上海舜宇恒平科技仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；101-0电热恒温鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；磁力搅拌器、超微粉碎机，德国IKA仪器有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；真空冷冻干燥机，美国利曼公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦有限公司；扫描电子显微镜（SEM）。

1.2 试验方法

1.2.1 复合B族维生素微胶囊的制备 配制芯材溶液：取维生素B2于试剂瓶中，加入适量的纯净水，在80℃水浴且避光条件下使其充分溶解，放置在冰箱中冷却后混入其它3种维生素，混匀使其溶解，即得芯材溶液。比例为VB1∶VB2∶叶酸∶烟酰胺=2∶2∶1∶20 m/m，是依照“中国居民膳食营养素参考摄入量表”需要量制定的。

配制壁材溶液：称取一定量CMC，用纯净水溶解，80℃水浴条件下加热、搅拌，直至其溶解完全，在30～50 MPa下高压均质，重复3次。另取一定量明胶用纯净水溶解，50℃水浴加热，搅拌加速其溶解，在30～50 MPa下高压均质，重复3次，混合两种壁材溶液。

混合溶液配制：按照一定的壁材质量百分浓度、壁材比和壁芯比，将壁材溶液和芯材溶液混合，釆用高速匀浆机10 000 r/min快速分散30 s，重复3次，并采用磁力搅拌机搅拌，使其充分混匀。将混合物倒入培养皿中，厚度不宜过大，放入冰箱冷冻层，使其冻结后放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥。

粉碎：取一定量的冻干的微胶囊，在避光条件下，用超微粉碎机粉碎，过100目筛，得成品微胶囊，放在干燥器中备用。

1.2.2 HPLC法分离4种混合B族维生素 对照品溶液的配制：分别准确称取 VB1、VB2、叶酸、烟酰胺对照品各2 mg（精确至0.01 mg），用高纯水溶解并定容至10 mL，得到200 mg/L的对照品储备液，于4℃冰箱中保存。使用时分别精密量取各标准品储备液100 μL，用高纯水定容至1 mL，即得20 mg/L的混合对照品溶液。

色谱条件的确定：流动相A为：乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.03 g，庚烷磺酸钠 1.1 g，再分别精密加入异丙醇2.0 mL，三乙胺1.5 mL，加纯净水定容至1.0 L，用冰醋酸调节pH值至3.5，过0.45 μm有机滤膜。流动相B为甲醇溶液。最适宜的梯度洗脱条件见表1，流速：1.0 mL/min。其它色谱条件如下：色谱柱：Agilent C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm）；柱温：30℃；检测波长：267nm；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Table1 Gradient elution program of mobile phase

1.2.3 方法学验证试验 线性关系的考察：精密吸取质量浓度分别为 12.5，25，50，100，150，200 μg/mL的4种B族维生素混合对照品溶液，按照上述色谱条件进样，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得到4种B族维生素的线性回归方程，相关系数R2，以各化合物的信噪比（S/N）为3时的相应浓度确定检测限（LOD），以各化合物的信噪比（S/N）为10时的相应浓度确定定量限（LOQ）。

精密度及稳定性试验：取配制好的对照品混合溶液重复进样，条件同1.2.2节，记录各B族维生素的峰面积，从而计算各化合物的精密度。取同一样品溶液，按上述色谱条件，每隔3 h进一次样，共进4次样，记录峰面积。对溶液的稳定性进行考察，用RSD值表示。

加标回收率试验：准确称取已知B族维生素含量的样品1 g，精密加入一定量的对照品溶液，做3个平行，按照1.2.2节的方法制备对照品溶液，进样测定，计算每种维生素的平均回收率和RSD值。

1.2.4 微胶囊包埋率的测定 芯材为4种B族维生素的混合物，因烟酰胺在整体的B族维生素添加量中所占比例较大，所以以烟酰胺为主要分析对象，通过对微胶囊中烟酰胺的含量和包埋率的分析，来反映B族维生素微胶囊整体的包埋效果。

微胶囊表层未包埋的烟酰胺含量测定：在避光条件下，取30 mg微胶囊于烧杯中，加入15 mL无水乙醇清洗，重复3次，过滤上清液，合并滤液，在 3 500 r/min，4℃条件下离心5 min，真空旋转蒸发至干，最后用1 mL纯净水复溶，过0.45 μm有机滤膜，放在棕色进样瓶中，4℃下保存备用。之后按上述色谱条件进样，测定B族维生素含量。

微胶囊中全部烟酰胺含量测定：在避光条件下，取30 mg微胶囊于烧杯中，加入10 mL纯净水，超声溶解，重复3次，在3 500 r/min，4℃条件下离心5 min，从中吸取一定量上清液，测定方法同上。

微胶囊包埋率计算公式如下：

包埋率=（1-微胶囊表面维生素含量/微胶囊总维生素含量）×100%

1.2.5 维生素微胶囊制备工艺 单因素试验选取壁材质量百分浓度，明胶与CMC的比例，芯材与壁材比例这3个因素逐次进行单因素试验。各因素水平如下：

壁材质量分数：1%，2%，3%，4%；明胶∶CMC：1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1；壁材∶芯材：4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4。测定各因素下微胶囊的包埋率。

1.2.6 响应面优化微胶囊的制备工艺 由单因素试验结果，选取较好的水平条件设计3因素3水平的响应面优化试验，对试验结果进行回归拟合分析，得到最佳工艺条件。

1.2.7 微胶囊产品表面形态的观察 采用扫描电子显微镜（SEM）观察真空冷冻干燥制得的维生素微胶囊产品的表面形态，同时选取本实验室喷雾干燥法自制的维生素微胶囊样品进行对比，样品的处理方法如下所示：在样品台上贴上一层双面胶，将粉碎后的微胶囊粉末轻轻撒在样品台上，然后将多余的粉末轻轻吹去，最后在微胶囊样品上喷金，加速电压为10 kV，观察时间越短越好，否则会引起电子损伤。

1.2.8 微胶囊的缓释动力学性质研究 模拟胃液配制：取3.2 g胃蛋白酶和2 g氯化钠，加入7 mL盐酸和水使溶解至1 000 mL，即得，该溶液pH值为1.2。

肠液配制：取磷酸二氢钾6.8 g，加水250 mL使溶解加0.2 mL/L氢氧化钠溶液77 mL和500 mL水，再加胰蛋白酶10 g使其溶解后，用氢氧化钠溶液或0.2 mol/L盐酸溶液调节pH至6.8，再加水稀释至1 000 mL。

方法：精确称取50 mg微胶囊，放置于试剂瓶中，之后加入100 mL模拟肠液或模拟胃液，把试剂瓶放置磁力搅拌器上，转速为100 r/min，每隔3 min，取表层上清液样品0.5 mL，适当浓度稀释后，测定其中B族维生素含量，取样之后，立即补充0.5 mL模拟肠液或模拟胃液，从而测定B族维生素的释放率，考察微胶囊中的B族维生素在模拟肠液和模拟胃液中的最终释放情况。

2 试验结果与讨论

2.1 HPLC结果分析

通过将混标色谱峰，单标色谱峰的保留时间进行比较，得出出峰顺序依次为烟酰胺，叶酸，维生素B2，维生素B1。由图1可知，色谱峰分离效果显著，峰形良好，无拖尾现象。所以本试验建立的HPLC法适用于分离该4种B族维生素。

2.1.1 线性关系考察 由表2可知，烟酰胺，叶酸，VB2，VB14种 B 族维生素在 12.5～200 mg/L 的浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数R2均大于0.99，检出限LOD和定量线LOQ如表所示，由结果可知，该方法具有良好的线性关系，且灵敏度较高，该HPLC方法可行。

2.1.2 精密度、稳定性及加标回收率试验结果由表3可知，烟酰胺，叶酸，VB2，VB1的精密度试验的RSD（%）值分别为 1.37，1.45，0.97，1.24，说明仪器的精密度良好。在稳定性试验中，4种供试品溶液的RSD（%）值说明样品液在24 h内稳定。加标回收率试验中，平均回收率范围在98.52%～104.70%，回收率均较高，且回收率的RSD值较小，表明该方法结果可靠。

图1 4种B族维生素混合对照品的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram of 4 miexed vitamins B

表2 线性关系考察结果Table2 The result of linear relationship

表3 精密度，稳定性与平均回收率试验结果Table3 Precision，stability and average recovery test results

2.2 维生素微胶囊制备工艺单因素试验结果

图2 壁芯比对包埋率的影响Fig.2 Influence of ratio of wall material and core material on the embedding rate

在壁材质量分数为2%，壁材质量比明胶∶CMC为1∶1的条件下，研究壁芯比对微胶囊化的影响，微胶囊的包埋率结果如图2所示，由图可知，随着壁材比例的增加，包埋率呈现逐渐增大的趋势，当壁芯比例为3∶1时，包埋率达到最大值。超过3∶1时，包埋率又逐渐降低。所以确定3∶1为最佳壁芯比。

在壁材质量百分浓度为2%，壁芯比为3∶1的条件下，研究不同壁材比例（明胶∶CMC）下微胶囊的包埋率结果如图3所示，由图可知，壁材中明胶含量大于CMC含量时，其包埋率较高，随着明胶在壁材比例中的增加，包埋率也逐渐增高，当比例为1∶1和1∶2时，包埋率达到最大，且差异不明显，超过2∶1后，包埋率又逐渐减小，综合考虑选择明胶∶CMC=2∶1为最佳壁材比。

不同的壁材质量分数对微胶囊的包埋率的影响结果如图4所示，由图可知，壁材质量分数范围在0.5%～2%之间时，微胶囊的包埋率随着浓度的增加而增大，当壁材质量分数达到2%时，包埋率最大为87.7%。但超过2%后，包埋率又逐渐降低。所以选择最佳的壁材质量分数为2%。

图3 壁材比对包埋率的影响Fig.3 Influence of ratio of material on the embedding rate

2.3 响应面优化微胶囊的制备工艺

根据单因素试验结果，选择壁芯比、壁材比、壁材质量分数为优化因素，以微胶囊的包埋率为衡量指标，采用Box-Behnken设计，进行响应面分析。响应面试验因素水平表如表4。

响应面设计试验结果如表5所示。

图4 壁材质量分数对包埋率的影响Fig.4 Influence of the concentration of wall material on the embedding rate

表4 响应面试验因素水平表Table4 Design of response surface factors

表5 响应面设计试验结果Table5 The experimental results of response surface design

通过 Design expertv7.1.6软件对试验数据进行多项拟合回归，以包埋率（Y）为因变量，壁材质量分数（A），壁芯比（B）和壁材比（C）三因素为自变量，建立回归方程如下：

Y=88.52+2.57A-1.08B-0.32C-2.21AB+0.55AC+2.95BC-3.93A2-4.55B2-1.93C2

回归方程的可信度见表6所示。

表6 回归方程的可信度分析Table6 The reliability analysis of the regression equation

由表6可知，复相关系数为98.69%，说明该回归方程可信度较高，该模型可解释超过98.69%的试验数据。CV值的大小与试验的稳定性相关，本试验中具有较低的CV值为0.91%，表明试验稳定较好，并具有较高的可靠性。由此可知，已建立的回归方程模型可用于B族维生素微胶囊的制备方案的优化。

表7 模型的显著性检验与方差分析Table7 Significance test and analysis of variance of the model

如表7所示，此模型P＜0.0001，该模型具有显著意义。在此回归模型中有7个显著项，分别为：A、B、AB、BC、A2、B2、C2，R2为 98.69%，表明该方程有显著的回归效果。回归方程中一次项的系数和因素壁材质量分数（A），壁芯比（B），壁材比（C）的平方项系数都比较大，这表明上述3个因素对响应值的结果影响并不是普通的线性关系；同时方程中交互项AB和BC的系数较大，说明A、B之间，B、C之间具有一定的交互作用。

通过Design expert.8.05b软件处理回归方程，3个因素中每两种因素对包埋率影响的响应面结果如图5～图7所示。

由图可以确定壁材质量分数（A）、壁芯比（B）、壁材比（C）对包埋率的影响，由响应曲面图可以直观得到每个因素对结果的影响大小。由方差分析结果和响应曲面图可以看出壁材质量分数、壁芯比对B族维生素微胶囊的包埋效率的影响较为显著；壁材质量分数和壁芯比、壁芯比和两种壁材之间的比例的交互作用显著。通过数学模型预测最优的条件为：壁材质量分数2%，壁芯比为2.41，壁材比为明胶∶CMC=1.75∶1，预测在此工艺条件下所得的微胶囊包埋率为89.2262%。

图5 壁材质量分数与壁芯比对微胶囊包埋率影响的响应面图Fig.5 Response surface plot of interaction between wall material concentration and core wall ratio on the embedding rate of microcapsule

图6 壁材质量分数与壁材比对微胶囊包埋率影响的响应面图Fig.6 Response surface plot of interaction between wall material concentration and wall material ratio on the embedding rate of microcapsule

图7 壁芯比与壁材比对微胶囊包埋率影响的响应面图Fig.7 Response surface plot of interaction between core wall ratio and wall material ratio on the embedding rate of microcapsule

2.4 最优条件与验证试验

为了验证模型预测的准确性，在较优条件（壁材质量分数2%，壁芯比2.41，壁材比为明胶∶CMC=1.75∶1），进行分子包埋试验，重复 3 次，3 次试验的平均包埋率为88.81%，与模型预测值相对误差仅为0.47%，这说明最优工艺条件下包埋率的实际值与模拟值相差较小，模型预测的工艺条件可用。

2.5 微胶囊产品的扫描电镜形态

如图8可以看出喷雾干燥和冷冻干燥这两种方式制备出的B族维生素微胶囊都为球状，喷雾干燥的微胶囊产品与真空冷冻干燥的微胶囊产品相比，在微胶囊个体大小上更加均一，且相对更加完整。而相对于真空冷冻干燥的微胶囊产品而言，喷雾干燥工艺制得的B族维生素微胶囊的表面出现了大量的凹陷现象，且各个微胶囊个体之间粘连较为严重，且表面不光滑，原因在于喷雾干燥制得的B族维生素微胶囊含水率较高，这很容易造成微胶囊中B族维生素在以后的储藏加工中损失，所以真空冷冻干燥方法制备的微胶囊具有更好的储藏性和稳定性，更适合于添加到食品中。

2.6 缓释动力学结果分析

由图可知，微胶囊进入模拟胃液后，3 min中时释放了60%，之后释放速度减缓，30 min以后释放率不再增加，且全部释放，几乎无损失。由于有机壁材在酸性介质中的溶解性较低，所以微胶囊对于维生素具有一定的缓释作用，可以一定程度上保护芯材。微胶囊进入模拟肠液后释放了77%左右，之后释放速度减缓，约在15 min时释放完全，释放速度要大于在胃液中的释放速度，是因为有机壁材明胶和羧甲基纤维素在中性和弱碱性环境中的溶解度要大于酸性介质环境中的溶解度，所以整体释放速度较快，但微胶囊还是从整体上起到了一定的缓释和保护作用。

图8 微胶囊扫描电镜图Fig.8 SEM micrograph of microcapsules

图9 B族维生素微胶囊在模拟胃液（a）、肠液（b）中的释放曲线Fig.9 Release curve of B vitamin microcapsules in simulated gastric juice and testinal juice

2.6.1 微胶囊在胃肠液中释放机理的研究

零级释放动力学

方程式为：Qt=Q0-k0t

式中，Q0和Qt各自表示最初释放基质中总的药物量和t时刻制剂中残留的量；k0表示零级释放常数。该模型常用来描述一些常见的糖衣药物和胶囊类药物的释放过程。

一级释放动力学

方程式为：Qt=Q∞（1-e-kt）

式中，Q∞表示释放终点释放出来的药物量总和；k是一级释放常数。符合该溶解曲线的药物制剂一般包括：包含水溶性药物的多孔基质

Higuchi模型

方程式为：Qt/Q0=kt1/2

该释放模型多用于液体药物以及药膏中分散的药物颗粒透过基质和皮肤的释放。其中，k为Higuchi的常数。

2.6.2 胃液模拟 通过以上拟合结果可知，相关系数R2在零级、一级动力学方程以及Higuchi方程中分别为 0.62191，0.96519，0.86309。综上，得出维生素微胶囊在模拟胃液中的释放遵从一级动力学方程。

2.6.3 肠液模拟 通过以上拟合结果可知，相关系数R2在零级、一级动力学方程以及Higuchi方程中分别为 0.38332，0.93727，0.66063。综上，维生素微胶囊在模拟肠液中的释放遵从一级动力学方程。

3 结论

图10 微胶囊在胃液模拟中动力学方程的拟合结果Fig.10 Results of kinetic equation fitting of microcapsule in gastric fluid simulation

图11 微胶囊在肠液模拟中动力学方程的拟合结果Fig.11 Results of kinetic equation fitting of microcapsule in intestinal fluid simulation

本试验以明胶和CMC为壁材，烟酰胺、叶酸、VB2、VB1为芯材，按照一定的添加比例，采用真空冷冻干燥法制备了包含4种B族维生素的复合微胶囊。建立了B族维生素高效液相色谱检测方法对包埋的B族维生素进行检测，色谱条件为：流动相A为庚烷磺酸钠溶液，流动相B为甲醇溶液梯度洗脱。流速为1.0 mL/min，色谱柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30℃；检测波长：267 nm；进样量：10 μL。通过单因素试验，研究了壁材质量分数、壁芯比、壁材比对微胶囊包埋率的影响，确定了最佳的壁材质量分数为2%，壁芯比为 3∶1，壁材比（明胶∶CMC）为 2∶1。通过 Box-Behnken设计试验，得到了复合微胶囊制备的最佳工艺，最优的条件为：壁材质量分数2%，壁芯比为2.41∶1，壁材比为1.75∶1，在此工艺条件下所得的微胶囊包埋率为88.81%。扫描电子显微镜图结果显示喷雾干燥比真空冷冻干燥具有更好的均一性和完整性，但表面凹陷和粘连作用比较严重。在微胶囊的缓释动力学的研究中得出：微胶囊在胃液中的释放速度小于在肠液中的释放速度，且均遵循一级动力学模型，所制备的微胶囊对维生素具有一定的缓释作用。