郑景霞 白春清 熊 华*

（1 南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌 330047

2 江西科技师范大学 生命科学学院 国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心 南昌 330013）

β-胡萝卜素（β-carotene）是具有多种功能的天然色素，其特殊的富电子共轭体系，可通过猝灭单线态氧和清除自由基发挥较好的抗氧化活性[1]，且其对心血管疾病[2]、结肠癌[3]等慢性疾病有显著的治疗效果。然而，β-胡萝卜素易受光、热、氧等的影响而发生降解，通过运载体系将其制备成制剂能够有效提高其应用价值。脂质体作为一种新型的功能成分载体制剂受到广泛的关注，将活性成分包埋于脂质体内可提高其稳定性，降低光、氧等对活性成分的破坏，同时，脂质体还具有较好的缓释作用、靶向性、细胞亲和性、无毒性与组织相容性[4-6]。目前含有单一β-胡萝卜素功能性成分的脂质体制剂已有研究报道[7-9]，而其与其它功能性成分复合的制剂还鲜有报道。薏苡仁油 （Coix seed oil）是从药食两用性材料薏苡仁中提取的油脂，研究表明其富含不饱和脂肪酸，具有消炎、镇痛，抗癌等生理功能[10]。利用脂质体将β-胡萝卜素与薏苡仁油同时包埋，制备包含两种功能性成分的复合脂质体制剂，一方面能够给β-胡萝卜素提供保护屏障，有效减缓其降解速度；另一方面能利用薏苡仁油对β-胡萝卜素的溶解作用使整个体系分散更加均匀，进一步提高体系的稳定性，形成具有多种功效且氧化稳定性良好的复合制剂。

本研究采用乙醇注入法制备β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体，以β-胡萝卜素包封率及粒径分布为考察指标，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面法优化复合脂质体的制备工艺条件[11]，并对样品的形态分布及氧化稳定性进行考察，为复合脂质体制剂开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-胡萝卜素，购于美国Sigma公司；薏苡仁油，广州合诚三先生物科技有限公司；蛋黄卵磷脂，北京solarbio科技有限公司；胆固醇，上海蓝季科技发展有限公司；DPPH，购于美国Sigma公司；二氯甲烷、乙醇、正己烷均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 设备与仪器

85-2恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；SHZ-DⅢ循环水真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；722N可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Zetasizer Nano粒度电位仪，马尔文仪器公司（中国）；H-600透射电子显微镜，日本Hitachi集团。

1.3 方法

1.3.1 β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的制备

采用乙醇注入法制备复合脂质体[12]。将处方量的蛋黄卵磷脂、胆固醇、薏苡仁油及新配制的β-胡萝卜素-二氯甲烷溶液（1 mg/mL）溶于10 mL乙醇，待充分溶解后，将其缓慢滴加到一定体积的PBS缓冲液（0.02 mol/L）中，滴加完成后继续恒温搅拌20 min，再于振荡器中振荡水化20 min，得粗脂质体。将粗脂质体在42℃真空条件下旋转蒸发除去乙醇及二氯甲烷后，加蒸馏水定容至起始体积后，超声处理30 min，充入氮气、密封后于4℃储存。同法制备空白脂质体、β-胡萝卜素脂质体及薏苡仁油脂质体作对照。

1.3.2 β-胡萝卜素包封率的测定

1.3.2.1 β-胡萝卜素标准曲线的建立 准确称取10 mg β-胡萝卜素溶于10 mL二氯甲烷，配置成1 mg/mL的β-胡萝卜素溶液，取1 mL该溶液用正己烷定容至10 mL，配置成0.1 mg/mL的β-胡萝卜素母液，分别取 0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4 mL β-胡萝卜素母液于 10 mL 容量瓶，用正己烷定容至10 mL，以正己烷为空白对照，分别稀释成 0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 μg/mL浓度梯度的β-胡萝卜素溶液，于450 nm处测吸光度，得到标准曲线：Y=0.208C+0.002，R2=0.998。

1.3.2.2 β-胡萝卜素包封率的计算 （EE） β-胡萝卜素包封率的测定采用有机溶剂萃取法[13]。取适量脂质体至于10 mL刻度离心管中，加入4 mL正己烷，涡旋混合1 min后，5 000 r/min离心10 min，取上层正己烷液，重复提取2次后，合并正己烷液，并用正己烷定容至10 mL，以正己烷为空白，测定样品在450 nm处吸光度A0，通过标准曲线计算游离β-胡萝卜素含量。向上述萃取后的脂质体中加入定量乙醇，涡旋混合10 s后，超声破乳10 min，加入4 mL正己烷，5 000 r/min离心10 min，取上层正己烷液，重复提取2次至脂质体呈乳白色，合并正己烷液，继续用正己烷定容至10 mL，测定吸光度A1。将A0和A1分别代入β-胡萝卜素标准曲线方程计算游离β-胡萝卜素含量C0和被包埋β-胡萝卜素含量C1。通过以下公式计算EE：

1.3.3 单因素考察 基本工艺条件：卵磷脂与胆固醇质量比（5∶1，w/w）、薏苡仁油 6 mg、β-胡萝卜素-二氯甲烷溶液（1 mg/mL）0.6 mL溶于10 mL乙醇，PBS缓冲液 pH为 6.8、体积为 25 mL，搅拌温度45℃。试验过程中固定其它条件不变而只改变某一单一条件，分别考察薏苡仁油添加量、卵磷脂与胆固醇质量比 （w/w）、β-胡萝卜素添加量、PBS缓冲液用量、搅拌温度及PBS缓冲液pH值等6个因素对β-胡萝卜素的包封率和脂质体粒径分布的影响，根据试验结果确定影响较大的因素。

1.3.4 Box-Behnken响应面法优化β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体制备工艺 通过单因素考察，选取对β-胡萝卜素包封率和脂质体粒径分布影响较大的3个因素：脂质体制备温度（A）、卵磷脂与胆固醇的质量比（B）、PBS缓冲液用量（C），以β-胡萝卜素的包封率EE（Y）为响应值，采用Box-Behnken响应面优化制备工艺。

1.3.5 β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的形态表征

1.3.5.1 粒径分布及Zeta电位 取β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体1 mL，用蒸馏水稀释至10 mL以防止微粒聚集影响测定结果，随后装入特定的比色皿中进行测定，采用马尔文Zetaszier Nano-ZS粒径分析仪测定脂质体的粒径分布、多分散性系数及Zeta电位。

1.3.5.2 透射电子显微镜观察（TEM） 采用磷钨酸负染法[14]对β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体进行前处理，取适量样品滴于铜网上，用滤纸吸干边缘多余的样品后，将铜网浸泡于0.01 g/mL的磷钨酸钠溶液中染色2 min，取出后用滤纸吸干边缘多余溶液后自然晾干，用透射电镜观察脂质体的形态结构。

1.3.6 DPPH自由基清除能力 分别取2 mL脂质体，加入2 mL DPPH乙醇溶液（0.4 mmol/L），混合后避光放置1 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液在517 nm测吸光度，对照以乙醇代替DPPH溶液，测得At；以蒸馏水代替样品与DPPH溶液反应，同样以蒸馏水和乙醇混合液为对照，测得Ac，计算公式为：

2 结果与分析

2.1 单因素考察

2.1.1 薏苡仁油添加量的影响 固定其它条件不变，只改变薏苡仁油的添加量（0，2，4，6，8，10，12 mg），制备复合脂质体，考察薏苡仁油添加量对复合脂质体粒径分布及包封率的影响。结果如图1所示，加入薏苡仁油后，β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的粒径有所增大，且β-胡萝卜素的包封率有所降低，可能是薏苡仁油占据了一部分脂质体囊结构，使游离的β-胡萝卜素数量增多，从而降低包封率，但是，随着薏苡仁油含量的增高，β-胡萝卜素的包封率及粒径分布变化不明显，可能是体系中被包埋的β-胡萝卜素及薏苡仁油达到相对平衡。

2.1.2 卵磷脂与胆固醇质量比的影响 固定其它条件不变，只改变卵磷脂与胆固醇质量比（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，7∶1），固定胆固醇的添加量为20 mg/10 mL乙醇，制备复合脂质体，考察卵磷脂与胆固醇质量比对复合脂质体粒径分布及包封率的影响。结果如图2所示，随着卵磷脂与胆固醇质量比的增大，β-胡萝卜素的包封率先增大后趋于稳定，粒径先减小后趋于稳定，胆固醇作为类脂膜的重要组分，比例过大时，组成脂质体的卵磷脂量太少，脂质体膜不易形成，而且胆固醇可能会降低脂溶性物质对脂质双分子层的插入[15]，过低的卵磷脂与胆固醇质量比使得磷脂双分子层排列不够紧密，且形成的脂质体数量有限不足以包埋所添加的β-胡萝卜素及薏苡仁油[16]。而当卵磷脂与胆固醇质量比增大到5∶1时，脂质体数量达到要求，且磷脂双分子层膜的流动性降低，致密性和刚性有所增加[17]，从而提高药物的包封率。

图1 薏苡仁油添加量的影响Fig.1 Effect of concentration of coix seed oil on EE of β-carotene and particle size distribution

2.1.3 β-胡萝卜素添加量的影响 固定其它条件不变，只改变β-胡萝卜素的添加量（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg），制备复合脂质体，考察 β-胡萝卜素添加量对复合脂质体粒径分布及包封率的影响。结果如图3所示，当β-胡萝卜素的添加量高于0.2 mg时，其包封率有缓慢增加的趋势，脂质体粒径相对也有缓慢降低的趋势，在卵磷脂和胆固醇形成的脂质体的包埋能力范围内，适当添加β-胡萝卜素有利于提高其包封率，也有利于磷脂分子有序排列从而形成分散情况更好的体系。

图2 卵磷脂与胆固醇质量比的影响Fig.2 Effect of mass ratio of lecithin to cholesterol on EE of β-carotene and particle size distribution

2.1.4 PBS缓冲液用量的影响 固定其它条件不变，只改变 PBS 缓冲液用量（10，15，20，25，30，35，40 mL），制备复合脂质体，考察PBS缓冲液用量对复合脂质体粒径分布及包封率的影响。结果如图4所示，随着缓冲液用量的增加，β-胡萝卜素的包封率先上升后趋于平稳，脂质体的粒径先下降后趋于平稳，缓冲液用量增加，脂质体浓度降低，分子聚集情况减少，更有利于双分子层的有序排列。

图3 β-胡萝卜素添加量的影响Fig.3 Effect of concentration of β-carotene on EE of β-carotene and particle size distribution

图4 PBS缓冲液用量的影响Fig.4 Effect of volume of PBS buffer on EE of β-carotene and particle size distribution

2.1.5 搅拌温度的影响 固定其它条件不变，只改变搅拌温度（25，35，45，55，65，75，85℃）制备复合脂质体，考察搅拌温度对复合脂质体粒径分布及包封率的影响。结果如图5所示，随着搅拌温度的升高，β-胡萝卜素的包封率先轻微波动后迅速下降，脂质体的粒径相对也先轻微波动后持续增大。搅拌温度为45℃时，β-胡萝卜素的包封率最高，脂质体粒径也较小，制备温度高于磷脂的相变温度才能提高脂质体膜的通透性使药物插入[18]，但是，过高的温度又会使磷脂膜的流动性增大，导致药物泄漏，粒径增大。

2.1.6 PBS缓冲液pH值的影响 固定其它条件不变，只改变 PBS 缓冲液 pH （5.8，6.0，6.4，6.8，7.0，7.4，7.8），制备复合脂质体，考察 pH 对复合脂质体粒径分布及包封率的影响。结果如图6所示，缓冲液的pH值低于6.4时，β-胡萝卜素的包封率较低，脂质体的粒径也较大。低pH值可能会使脂质体中的脂肪酸发生质子化而形成六角晶体，使脂质体膜的流动性增大，从而降低脂质体的稳定性，导致药物流失。

图5 搅拌温度的影响Fig.5 Effect of temperature on EE of β-carotene and particle size distribution

图6 PBS缓冲液pH值的影响Fig.6 Effect of pH value of PBS buffer on EE of β-carotene and particle size distribution

2.2 Box-Behnken响应面法优化β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体制备工艺

2.2.1 Box-Behnken试验设计及结果 采用Design-Expert 8.0.5.0对表1中的数据进行分析，以Y为响应值对自变量A、B、C进行模型拟合，得到二次多项式回归方程：

Y=77.34-5.65A+18.02B+13.47C-2.51AB-2.44AC-5.79BC-19.54A2-11.53B2-9.21C2（R2=0.9654，P=0.003，F=21.67，失拟度检验 P=0.1702＞0.05，F=2.83）

为检验方程的可信度，利用软件对其进一步分析，其分析结果如表2，该模型的F值21.67＞4，P值0.0003＜0.01，说明该模型是高度显著的，失拟相的F值为2.83，P值0.1702＞0.05，说明模型的失拟项不显著，可用于预测。方程的决定系数R2=0.9654＞0.95，表明实际值与预测值非常接近，该方程能够准确预测实际情况。方程的校正决定系数Radj2=0.9208表明该模型中响应值的变化92.08%由所选的自变量决定，进一步说明该模型能够准确预测出响应值与各个自变量之间的关系，且误差极小。综上所述，该模型拟合程度良好，可以用该模型对脂质体的制备工艺进行优化。

各个因素的F值可以反映出每个因素对胞内多糖产量的重要性，F值越大，说明对β-胡萝卜素的包封率的影响越显著[20]，由表2可知，各因素对复合脂质体中β-胡萝卜素包封率的影响程度顺序为：卵磷脂与胆固醇的质量比＞缓冲液的用量＞制备温度，其中卵磷脂与胆固醇的质量比、缓冲液的用量的影响极显著。

表1 Box-Behnken响应面试验设计及结果Table1 Design and results of Box-Behnken response surface analysis

表2 响应面二次模型方差分析Table2 Variance analysis of response surface quadratic mode

2.2.2 响应面交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.5.0对方程进行方差性和显著性检验后，根据二次多项回归方程拟合的结果，固定某一个因素，绘制Y与其它两个因素的三维响应曲面图和等高线图，响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[21]。如果等高线为椭圆，则表明两个因素之间的交互作用显著，如果为圆形则表明交互作用不显著[22]。

当固定PBS缓冲液体积不变时，随着卵磷脂与胆固醇的质量比的增加和制备温度的升高，复合脂质体内β-胡萝卜素的包封率先增大后减小，但变化范围较小，且等高线偏椭圆形，表明卵磷脂与胆固醇的质量比和制备温度两个因素的交互作用相对显著（图7a）。

当固定卵磷脂与胆固醇的质量比不变时，随着PBS缓冲液体积的增加和制备温度的升高，复合脂质体内β-胡萝卜素的包封率先增大后减小，但变化范围很小，等高线偏圆形，表明PBS缓冲液体积和制备温度两个因素的交互作用相对较弱（图7b）。

当固定制备温度不变时，随着卵磷脂与胆固醇的质量比和PBS缓冲液体积的增加，复合脂质体内β-胡萝卜素的包封率先增大后减小，且变化范围较大，等高线呈椭圆形，表明卵磷脂与胆固醇的质量比和PBS缓冲液体积两个因素的交互作用显著（图7c）。

图7 各因素交互作用对β-胡萝卜素包封率的影响Fig.7 Response surface and corresponding contour plots showing the effect of interaction of various factors on the EE of β-carotene

2.2.3 模型验证 根据Design-Expert 8.0.5.0综合分析，脂质体的最佳制备工艺为：制备温度42.78℃，卵磷脂与胆固醇质量比6.96∶1，PBS缓冲液的体积为24.76 mL/10 mL乙醇，理论的β-胡萝卜素的包封率为84.39%，为了检验响应面优化结果的可靠性，采用上述最佳工艺制备脂质体，考虑实际情况，设定制备温度为43℃，卵磷脂与胆固醇质量比为7∶1，PBS缓冲液的体积为25 mL/10 mL乙醇，得到的复合脂质体中β-胡萝卜素的包封率为81.22%，与理论值的相对误差为3.76%，试验值和理论值比较接近，说明该模型的预测性良好。

2.3 β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的表征

2.3.1 粒径分布及Zeta电位 测定结果显示，β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的平均粒径及多分散性指数受制备工艺的影响，在适当的工艺条件下，其平均粒径（AD）为（187.9±7.5）nm，多分散系数（PDI）为 0.104±0.09，平均 Zeta 电位为（-29.33±4.77）mV，说明β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体分散性良好，比较稳定。

2.3.2 透射电子显微镜观察 单一的β-胡萝卜素脂质体及β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的透射电镜结果如图8 a1、a2、b1、b2所示，结果显示，复合脂质体与单一的β-胡萝卜素脂质体都呈现出圆整、规则的球形，且都可观察到清晰的脂质体特有的纹理结构，未见颗粒聚集情况，但复合脂质体的分散效果明显比单一的β-胡萝卜素脂质体好，这可能是薏苡仁油的加入改善了β-胡萝卜素在体系中的溶解性，使其更顺利地包埋于脂质体体系中。

图8 β-胡萝卜素脂质体（a）与β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体（b）的透射电镜图Fig.8 TEM images of β-carotene liposome（a） and β-carotene-coix seed oil complex liposome

2.4 DPPH自由基清除能力

为了研究β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的氧化稳定性，以及薏苡仁油对体系的稳定作用。本试验首先制备了不同β-胡萝卜素与薏苡仁油质量比（1∶1、1∶5、1∶10，m∶m）的复合脂质体，然后以空白脂质体：L（CG）、薏苡仁油脂质体：L（cso）、β-胡萝卜素脂质体：L（β-c）为对照，对以上样品在贮藏期间DPPH自由基清除能力进行了测定及分析。

各种脂质体DPPH自由基清除能力结果如图9所示，结果表明，较空白脂质体而言，单一的β-胡萝卜素脂质体和薏苡仁油脂质体都有更强的DPPH自由基清除能力，且薏苡仁油脂质体的抗氧化能力更强，β-胡萝卜素凭其特有的共轭结构也能够有效清除DPPH自由基，而薏苡仁油富含亚油酸、油酸等不饱和脂肪酸，其不饱和共价键能够与DPPH自由基发生反应而消除自由基[23]，同时，复合脂质体的DPPH自由基清除能力比单一的脂质体都强，且随着薏苡仁油含量的升高，DPPH自由基清除能力明显增强，说明将β-胡萝卜素与薏苡仁油复合能够提高体系的抗氧化能力。

图9 L（CG）、L（cso）、L（β-c）、L（β-c+cso）1∶1、L（β-c+cso）1∶5、L（β-c+cso）1∶10 的DPPH 自由基清除能力Fig.9 DPPH radical-scavening activity of L（CG），L（cso），L（β-c），L（β-c+cso）1∶1，L（β-c+cso）1∶5 and L（β-c+cso）1∶10

3 结论

本试验通过Box-Behnken响应面法优化出β-胡萝卜素-薏苡仁油复合脂质体的最佳制备工艺条件为：制备温度43℃，卵磷脂与胆固醇质量比7∶1，PBS缓冲液的体积为25 mL，该条件下β-胡萝卜素的包封率的理论值为84.39%，与实际值81.22%基本一致，模型方程高度显著，拟合性良好。表征结果显示复合脂质体的平均粒径为（187.9±7.5）nm，多分散系数为 0.104±0.09，平均Zeta电位为 （-29.33±4.77）mV其形态分布均匀，有脂质体特有的清晰的纹理结构，且较单一的β-胡萝卜素脂质体而言，其分布状况更好。DPPH试验显示复合脂质体清除DPPH自由基的能力随着薏苡仁油含量的提高而明显增强，说明将二者复合能够有效提高体系的氧化稳定性。

本研究将为新型的复合脂质体的制备奠定一定的理论基础，同时将为类胡萝卜素与植物油的共同利用提供依据。