李慧婷 李 娓 郭锐华 费迎心 吴文惠 包 斌*

（1 上海海洋大学食品学院 上海 201306

2 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心 上海 201306

3 国家淡水水产品加工技术研发分中心 上海 201306）

恶性肿瘤是临床常见疾病，也是当前及今后相当长一段时间内威胁人类健康和导致死亡的主要原因[1-2]。肿瘤病人因肿瘤异常生长和代谢、疼痛、梗阻而存在不同程度的营养不良[3]。基于免疫与营养密切相关，采用合理的营养支持改善肿瘤患者机体的免疫功能，成为食品研究的前沿方向。应用肠内营养支持辅助治疗癌症及危重病患者也受到越来越多的重视[4]。

研究表明，肠内营养（Enteral nutrition，EN）可以改善肠道功能，减少内毒素入血和体内炎症介质的释放[5]。肿瘤型肠内营养制剂主要应用在重症患者手术前、后以及放疗和化疗期间[6]。目前我国肠内营养制剂主要来自于欧洲进口[7]，国内上市的EN制剂产品所采用的主要原材料为陆源性动植物及其提取物，其中蛋白质源主要为大豆蛋白、牛奶蛋白和鸡蛋蛋白或水解植物蛋白及其衍生物[8]。用新型蛋白源开发安全有效的肠内营养制剂，也是临床EN制剂领域或特殊医学用途配方食品领域的重要研究内容。

沙蚕属于药食同源的海洋生物，也是鱼虾的天然饲料[9]。双齿围沙蚕具有补脾益胃、补血养血、利水消肿等功效。其营养成分丰富，氨基酸含量占干重的67.43%，脂肪酸含量占干重的14.24%，其中 EPA 含量为 6.53%，还含有 Cu、Sn、Se、Hg、As、I、Zn和Cd等多种微量元素[10-11]。沙蚕中含有的超氧化物歧化酶、纤维蛋白溶解酶、纤维酶原激活物、胶原酶等活性成分具有优良的抗衰老、抗肿瘤、抗炎症和预防高血压、消除动脉硬化等功效[12-13]。沙蚕蛋白中高比例的精氨酸和谷氨酰胺可通过维持免疫细胞的功能性完整来支持重症患者免疫系统的内环境稳态[14-16]。沙蚕中含有的ω-3脂肪酸，能有效延迟炎症反应，预防自由基损伤[17]。

鉴于双齿围沙蚕的药食同源特性和抗肿瘤等免疫调节作用，以双齿围沙蚕的营养成分为基础，根据肠内营养制剂的配制要求和质量指标，将双齿围沙蚕作为EN制剂的蛋白质来源，制备适用于早期肝癌前病变患者的EN制剂，研究其对肝癌前病变动物模型的营养指标、炎症指标和肝功能指标的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 双齿围沙蚕 （Perinereis Aibuhitensis），盐城丰悦源钓饵有限公司提供；立适康营养配方粉，西安力邦临床营养有限公司提供。

1.1.2 实验动物 清洁级ICR雄性小鼠72只，7周龄，体重30～35 g，购自上海杰思捷实验动物中心，合格证号：SCXK（沪）2013-0006。

1.1.3 主要试剂 二乙基亚硝胺 （DEN）：0.95 g/m，99 mL生理盐水加1 mL DEN振荡混匀为1%的DEN溶液（4℃保存），上海蒙昌仪器有限公司（批号：DD200068）；试剂盒：IL-2和 TNF-α 检测试剂盒，上海博湖生物科技有限公司 （批号：201609）。

1.1.4 主要仪器 H1750台式高速离心机，日本HITACHI；MiniPRESS-ⅡSF 压片机，Rimek公司；SH-1000型酶标仪，日本HITACHI；迈瑞（Mindray）全自动生化仪BS-180，深圳迈瑞生物医学电子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 双齿围沙蚕肠内营养片剂的制备 将双齿围沙蚕分别用1%柠檬酸和10%食盐水溶液高速旋转洗涤，随后，匀浆冻干磨成粉末，过40目筛制成沙蚕粉。双齿围沙蚕的营养成分分析见表1。

表1 双齿围沙蚕的营养成分分析Table1 Nutritional composition analysis of Perinereis aibuhitensis

以双齿围沙蚕为蛋白源，并添加精氨酸、L-谷氨酰胺、ω-3脂肪酸，以及复合维生素和复合矿物质，用MiniPRESS-ⅡSF压片机压制成中心厚度0.8 mm的肠内营养制剂。

每100 g，所含热量为1 968 kJ，其中蛋白质供能比为20%、脂肪供能比为15%、碳水化合物供能比为65%。

1.2.2 小鼠早期肝癌前病变模型建立 建立小鼠早期肝癌前病变模型方法如下：清洁级ICR小鼠正常饲养1 w后禁食12 h，腹腔注射1%DEN溶液0.1 mL/10 g，1/w，连续注射 4 w，建立小鼠早期肝癌前病变模型。第4周末小鼠再次禁食12 h（只禁食不禁水），取肝脏做HE染色观察其病理变化。

1.2.3 小鼠分组及肠内营养支持 清洁级ICR小鼠 72 只，体重 30～35 g，雄性，正常饲养 1 w，购自上海西普尔必凯有限公司。将小鼠随机分为沙蚕处理组1（A 60%双齿围沙蚕蛋白/总蛋白，质量比）、沙蚕处理组2（B 40%双齿围沙蚕蛋白/总蛋白，质量比）、沙蚕处理组3（C 20%双齿围沙蚕蛋白/总蛋白，质量比）、阳性对照组（立适康）、空白组和对照组 （腹腔注射与DEN等体积的0.9%生理盐水溶液），每组12只，分组情况如表2。

自首次注射12 h起，A组、B组和C组按1 320.06 kJ/kg/d给予不同取代度的双齿围沙蚕肠内营养制剂 （2片/只/d），D组给予相同热量的立适康肠内营养制剂（2片/只/d）。E组和F组给予相同热量的饲料。每组每晚21：00投予对应食物，其它时间自由饮水。连续喂养4 w。其中，D组（立适康营养配方粉）每100 g粉剂含1 817 kJ能量，蛋白质功能比为35%、脂肪功能比为19%、碳水化合物功能比为20%。

表2 各组处理情况表Table2 Processing table of each group

1.2.4 检测指标

1.2.4.1 小鼠形态 每天观察各试验组小鼠进食情况与体毛特征变化，每周记录两次小鼠体重变化和存活率。

1.2.4.2 营养指标 分别在注射DEN溶液第1，2，3，4周禁食12 h后，心脏取血，加入1%EDTA二钠溶液抗凝，3 000 r/min离心5 min，取上清液，用全自动生化分析仪测定血浆总蛋白（Total Protein，TP）和白蛋白（Albumin，Alb）浓度。

1.2.4.3 肝功能指标 分别在注射DEN溶液第1，2，3，4 周禁食 12 h 后，心脏取血，加入 1%EDTA二钠溶液抗凝，3 000 r/min离心5 min，取上清液，用全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Transaminase，AST）浓度。

1.2.4.4 肝组织形态 小鼠注射DEN溶液第4周后，禁食12 h，取肝脏，以100 g/L甲醛固定，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，制成组织病理切片，光学显微镜下 （10×40倍）观察肝脏组织形态学变化。

1.2.4.5 炎症指标 分别在注射DEN溶液第1，2，3，4周禁食12 h后，心脏取血，加入1%EDTA二钠溶液抗凝，3 000 r/min离心5 min，取上清液，用ELISA试剂盒测定小鼠肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）水平。

1.2.5 数据统计 所有数据全部采用SPSS软件处理，计量资料均用±s表示，采用单因素方差分析进行检验，规定P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 实验动物形态及体重的变化

F组小鼠处理期间正常进食和饮水，活动正常，背毛光泽柔顺，无死亡。3 w后，除F组外，其余各组小鼠背毛凌乱，精神萎靡，食欲减退，活动减少。试验过程中每周称取小鼠体重2次，体重变化如图1。

图1 给药小鼠注射前后1月的体重变化Fig.1 Changes of body weight before and after administration of drug injection in mice in one month

各组小鼠在试验开始前D1体重没有显著差异，营养支持4 w后，各组小鼠体重明显上升，从35.74 g 分别增加到 43.75，42.98，42.87，42.56，40.98和 46.63 g。

F组体重增加明显高于A组、B组、C组、D组和E组（P＜0.01）；A组体重增加显著高于E组（P＜0.05）；B组和C组之间小鼠体重差异无统计学意义 （P＞0.05）；A组与B组和C组之间小鼠体重差异有统计学意义 （P＜0.05）；D28，A组比E组小鼠体重增加 61.49%（P＜0.05），见图1。

D28后，F组小鼠无死亡，死亡率为0%，除F组外，其余各组每组死亡1只，死亡率为8.30%。

2.2 双齿围沙蚕EN制剂对DEN诱发小鼠肝癌前病变模型的营养指标的影响

检测肝癌前病变小鼠D7，D14，D21和D28的血浆TP和Alb含量，如图2和图3所示。

图2 早期肝癌前病变小鼠TP指标的变化Fig.2 Changes of TP index in mice with early liver cancer

与E组相比A组、B组和C组的TP含量有所增加，D7，A组的TP与B组、C组、D组无显著性差异 （P＞0.05），D14、D21和 D28，A 组的TP 显著高于B组和C组（P＜0.05），分别高了12.37%，9.35%，8.73%和 3.30%，11.41%，9.76%；A 组的TP含量与E组相比，显著升高30.32%。

与E组相比A组、B组和C组的Alb含量有所增加，D7，A组的Alb与B组、C组、D组无显著性差异 （P＞0.05）；D14，A 组的Alb与 B组无显著性差异（P＞0.05），与 C 组差异性显著（P＜0.05），D21和D28，A组显著高于B组、C组和D组 （P＜0.05）。D28，A组的Alb含量与E组相比，显著高了13.68%。

图3 早期肝癌前病变小鼠Alb指标的变化Fig.3 Changes of Alb index in mice with early liver cancer

2.3 双齿围沙蚕EN制剂对DEN诱发小鼠肝癌前病变模型的肝功能指标（ALT和AST）的影响

检测肝癌前病变小鼠D7，D14，D21和D28的血浆ALT和AST含量，如表3和表4所示。

A组的ALT显著低于E组高于F组（P＜0.05），其中A组显著低于B组和C组 （P＜0.05）；D7和D14，A组的显著低于E组，分别低了39.50%和106.04%，D21和D28，A组的ALT水平比E组低47.76%（P＜0.05）和 83.75%（P＜0.05）。

A组的AST显著低于E组高于F组（P＜0.05），其中 A组显著低于 B组和 C组 （P＜0.05）；D7，A组和B组的AST显著高于D组（P＜0.05），分别高了12.97%和5.12%，D14、D21和D28差异性不显著；D28，A组的AST水平比E组低128.20%（P＜0.05）。

表3 早期肝癌前病变小鼠ALT水平（U/L）Table3 Changes of ALT level in mice with early liver cancer （U/L）

表4 早期肝癌前病变小鼠AST水平（U/L）Table4 Changes of AST level in mice with early liver cancer （U/L）

2.4 双齿围沙蚕EN制剂对DEN诱发小鼠肝癌前病变模型病理变化分析

在光学显微镜下 （10×40倍）观察肝癌前病变小鼠肝脏组织形态学变化，如图4所示。

从组织切片图可以观察到，图F小鼠肝脏结构清晰，胞浆红染，圆形核居中，染色质均匀，无显著炎性细胞浸润；图E小鼠肝脏纤维增生条索完全分割肝小叶，形成假小叶，肝细胞排列紊乱，肝窦狭窄，肝细胞水肿、脂肪变性，胞浆郁胆，核大可见核内包涵体，纤维间隔均匀纤细，可见大量巨噬细胞浸润；图A、图B、图C和图D小鼠肝脏肝细胞变性和核异型性减轻，巨噬细胞浸润减少，其中图A炎症最轻。

图4 各组肝癌前病变小鼠肝组织形态学切片图Fig.4 The histomophology of precancer tissue slice from rat live in each group

2.5 双齿围沙蚕EN制剂影响小鼠肝癌前病变模型炎症指标的变化

检测肝癌前病变小鼠D7，D14，D21和D28的血浆TNF-α和IL-2含量，如图5和图6所示。

由图5可知，A组的TNF-α水平显著低于E组高于 F组（P＜0.05）。D14，A 组与 B 组的TNF-α 显著低于 C组（P＜0.05），分别低了 5.39%和3.24%；D21和 D28，A组显著低于 B组和 C组（P＜0.05），分别低了 6.17%，7.16%和 6.13%，7.49%，比 E 组显著降低（P＜0.05），低了 23.36%和30.15%。

由图6可知，A组的IL-2水平显著高于E组低于F组（P＜0.05）。D7，A组和B组的IL-2显著高于 C组（P＜0.05），分别高了 8.28%和 6.25%，与D 组无显著性差异（P＞0.05）；D7、D14和 D28，A 组的IL-2显著高于B组和C组。

图5 早期肝癌前病变小鼠TNF-α指标的变化Fig.5 Changes of TNF-α index in mice with early liver cancer

图6 早期肝癌前病变小鼠IL-2指标的变化Fig.6 Changes of IL-2 index in mice with early liver cancer

3 讨论

恶性肿瘤的营养代谢表现为厌食、营养缺乏、体重下降等症状，宿主呈现恶液质，特别是肿瘤与宿主争夺能量和营养素，是导致死亡的主要原因[18-19]。因此，恶性肿瘤病人的合理营养支持受到普遍关注，肠内营养制剂或特殊医学用途配方食品得到快速发展。当肿瘤病人处于应激状态或进食状态时，肠道功能受损使细菌和内毒素入血而激活了巨噬细胞，导致体内TNF-α大量释放[20-21]。早期肠内营养支持可通过保护肠道结构和功能完整，减少肠道内毒素入血，从而降低体内炎症介质的释放[22]。由于重症患者机体易发生营养物质的合成代谢障碍，所以提供合理充分的外源性营养物质，能对肿瘤病人机体的合成代谢产生积极的促进作用[23]。

用DEN诱发小鼠肝癌模型是当前应用最为广泛的研究人类肝癌的一种理想动物模型，根据赵鹏等[24]用DEN建立大鼠肝癌前病变模型的方法，和毛文超等[25]用DEN建立小鼠肝癌前病变模型的方法，经过改良，使用大剂量（100 mg/kg）的DEN，间隔1周持续处理4次，能制备成肝癌前病变小鼠模型。试验结果显示，A组、B组、C组和D组小鼠肝脏病理组织切片镜下观察的癌变阳性率均低于E组，其中A组肝癌前病变改善最明显。表明双齿围沙蚕EN制剂具有降低DEN诱导的小鼠早期肝癌的发生率和抑制癌变进展的作用。

白蛋白和球蛋白组成血浆总蛋白，肝实质细胞合成白蛋白，占血浆蛋白质总量的40%～60%[26]。肝脏疾病患者蛋白的合成不足会导致白蛋白偏低，而总蛋白多种情况都会引起它的改变，轻微病变时总蛋白无显著性降低，病情较重的肝硬化、肝癌会出现明显的差异[27]。注射DEN小鼠在应用沙蚕EN制剂4周后，TP、Alb含量都显著高，其中A组的TP和Alb显著高于D组；B组和C组的Alb与D组比较无显著差异。试验过程中除了不同比例的沙蚕添加量，A组、B组、C组的营养配方组成完全相同，包括谷氨酰胺、精氨酸以及ω-3脂肪酸，说明EN制剂或特殊医学用途配方食品在添加量范围内补充更高含量的沙蚕蛋白可降低肝癌患者高代谢反应，促进血浆蛋白质的合成。

肿瘤患者抗感染能力减低，导致和促进单核细胞合成及释放TNF-α，同时，肿瘤患者体内某些复合物也能促进机体分泌TNF-α[28-29]。EN制剂通过刺激Peyer’s丛的M细胞，促进SIgA分泌，维持肠道免疫功能，显著降低TNF-α及C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平[30]。Jun Fan等[31]报道过与普通肠内营养相比，强化型谷氨酰胺EN制剂能显著降低体内TNF水平（P＜0.05）。沙蚕中含有丰富的谷氨酰胺。试验结果显示，与摄入普通鼠粮组小鼠相比，给予沙蚕EN制剂支持组小鼠能明显降低TNF值，这意味着炎症反应的缓解。与上述研究结果一致。从细胞免疫的角度出发，因为癌细胞分泌的大量免疫抑制因子可以抑制免疫细胞的活性，从而明显抑制IL-2的产生及反应性[32]。试验中沙蚕EN制剂支持组的IL-2与E组比较显著升高，说明添加沙蚕的EN制剂可以缓解早期肝癌前病变小鼠炎症反应，较好改善其营养状况。

ALT和AST是肿瘤病人肝脏重要指标，如果肝脏功能受到严重损伤，将导致细胞膜的通透性增强，ALT和AST从细胞中释放进入血液循环[33]。试验结果显示沙蚕EN制剂能够明显降低肝癌前病变小鼠ALT和AST水平，说明双齿围沙蚕EN制剂能减轻DEN对于小鼠肝脏的损伤，具有保护肝脏的功能。

我国EN制剂主要依靠进口，许多优质海洋生物资源需要开发[34]。试验制备的双齿围沙蚕EN制剂能够改善肝癌前病变小鼠的营养代谢状况，抑制肝脏受损，减轻炎症反应，且双齿围沙蚕蛋白占制剂总蛋白60%时，营养功效最显著，弥补了国内海洋型生物EN制剂的空白。试验得出的结论也能为今后沙蚕或其它海洋生物来源的添加物应用在特殊人群用肠内营养特殊食品提供宝贵的参考价值。