周梦莹，唐露静，黄檬檬，徐佳璐，鲁锴杰，朱欣，蒋明

（台州学院生命科学学院，浙江台州 318000）

大花无柱兰（Amitostigma pinguiculum）隶属于兰科（Orchidaceae）无柱兰属，为浙江特有种，主要分布在温州、金华、丽水和台州等地，通常生长在海拔250～400 m的潮湿且有覆土的岩石上或沟边草丛中，入国家Ⅱ级保护植物名录[1-2]。大花无柱兰为多年生草本植物，花型奇特、花色艳丽、姿态优美，具有很高的观赏价值，可用于盆栽、片植或点缀假山（见图1）；大花无柱兰的块茎、全草均可入药，具有活血化瘀和解毒消肿等功效[1]。近年来，由于山地开发、生境破坏和过度采挖等，大花无柱兰的植株数量急剧减少。大花无柱兰对生存环境的要求较高，繁殖能力较弱，根据笔者多年的野外观察和调查，该植物在部分地区已绝迹。大花无柱兰已列入《野生动植物濒危物种国际贸易公约》，该物种亟待研究和保护[2]。

图1 大花无柱兰及其生境Fig.1 Amitostigma pinguiculum and its habitat

近年来，分子生物学技术发展迅速，分子标记技术日新月异。限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）和相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）等已广泛应用于遗传多样性分析和种质资源鉴定等[3]。每种标记都有各自的优缺点，其中SRAP具有操作简便、结果稳定和多态性丰富等特点。基因外显子的G/C含量通常十分丰富，而非编码区序列，如启动子与内含子中A/T碱基较多，根据外显子的特点开发特定的SRAP引物用于扩增特定的片段[4-5]。SRAP分子标记已成功应用于马铃薯（Solanum tuberosum）、玉米（Zea mays）、甜瓜（Cucumis melo）、芒果（Mangifera indica）、茄子（Solanum melongena）等植物的遗传多样性研究[6-9]。目前尚无见有关大花无柱兰遗传多样性研究的报道。本研究采用SRAP分子标记技术，对10个居群的115份大花无柱兰材料的基因组DNA进行PCR扩增，并进行遗传多样性分析，旨在为该物种的保护和合理利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大花无柱兰实验材料分别采集自温州雁荡山、台州天台山、宁海逐步和金华方岩山等10个样地，共有样品115份（见表1）。采样时遵循随机原则，同一居群不同样点的间隔均在10 m以上。取新鲜、健康的叶片置于自封袋中，带回实验室后用大量的无菌水冲洗，晾干后置于－80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 叶片DNA的提取

称取0.1 g叶片放置在预冷的无菌研钵中，加入适量液氮用研棒磨成粉末。根据北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司的“新型植物基因组DNA快速提取试剂盒”的说明书提取DNA。

1.2.2 SRAP引物的筛选及PCR扩增

利用81对引物组合，对DNA样品进行PCR扩增与分析，筛选出多态性好、重复性高的引物组合。PCR反应采用优化后的体系（20 μL）：15.3 μL ddH2O、2.0 μL 10×缓冲液 、0.5 μL dNTPs（10mmol·L-1）、上游与下游引物各0.5 μL（20 μmol·L-1）、30 ng模板 DNA和0.4 μLTaqDNA聚合酶（2 U·μL-1）。PCR程序如下：94℃预变性5 min；94℃变性 1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 5个循环；然后94℃处理1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，总共 35个循环；72℃延伸 10 min；PCR样品保存于4℃冰箱备用。产物全部用于电泳，电泳在1%的琼脂糖凝胶上进行，电泳45 min（电压125 V、电流55 mA）后在凝胶成像系统上拍照记录。

表1 大花无柱兰10个居群的基本信息Table1 Sampling information of ten Amitostigma pinguiculum populations

1.2.3 数据分析

根据电泳结果统计条带数目，将强带或可分辨的弱带赋值“1”，其余赋值“0”，构建 0/1矩阵。利用PopGen 32软件进行数据分析，计算多态性条带比率（percentage of polymorphic loci,PPB）、Nei's基因多样性指数（H）、Shannon's指数（I）、遗传距离（D）、遗传一致性、总的居群基因多样性（Ht）、居群间基因分化度（Gst）和基因流（Nm）。采用Ntsys 2.0软件构建聚类分析图，参数采用默认值。

2 结果与分析

2.1 SRAP引物筛选及PCR扩增结果

引物筛选结果表明，共有9对引物可扩增出多态性丰富、重复性高、稳定性好的条带（见表2）。利用这9个引物组合对115份DNA样品进行SRAPPCR扩增，共得到305条谱带，片段大小主要在100～2 000 bp（见图2）。这些谱带均为多态性条带，PPB为100%。引物组合扩增得到的条带数在25～42，平均 33.89条；其中，ME5/em4组合扩增的条带最多，其次为ME9/em8（40条），ME1/em5组合最少。扩增的条带清晰且多态性丰富。

2.2 遗传多样性分析

在物种水平上，大花无柱兰的多态性比率（PPB）为100%，Nei's基因多样性指数（H）为0.209 8，Shannon's指数（I）为0.340 2；在居群水平上，PPB在24.59%～52.13%，平均为32.00%，其中HY的多态性最高，TT的多态性最低。H值在0.079 6～0.165 5，平均为0.100 9；I值在 0.120 9～0.252 3，平均为0.153 7。各居群H和I值的大小与PPB的高低大体一致，HY和FY 2个居群的大花无柱兰具有较高的遗传多样性，而TT、XS和YD 3个居群的遗传多样性较低。

表2 SRAP引物序列及扩增结果Table2 SRAP primer sequences and the results of amplification

图2 引物组合ME1/em5对部分大花无柱兰样品的SRAP扩增图谱Fig.2 SRAP amplification profiles of some Amitostigma pinguiculum samples with primer combination ME1/em5

2.3 不同居群的遗传分化

根据PopGen 32软件的计算结果，大花无柱兰总的居群基因多样性（Ht）为0.210 7，居群间基因分化度（Gst）为0.520 9，基因流（Nm）为0.459 9。根据居群间基因分化度估算，52.09%的遗传变异来自居群间，而47.91%的遗传变异源自居群内，居群内的遗传分化程度略低于居群间。

2.4 聚类分析

基于0/1矩阵，利用PopGen 32计算大花无柱兰各居群之间的遗传距离与遗传一致性，结果表明，各居群的遗传距离为0.091 9～0.198 4，平均为0.145 9；遗传一致性为0.823 1～0.912 2，平均为0.867 5。HY和YD之间的遗传距离最大，其次是HY与ZB，遗传距离最小的是居群KC和LT（见表3）。遗传一致性最低的是HY和YD，其次是HY和ZB，遗传一致性最高的是KC和LT，遗传距离和遗传一致性两者的表现规律一致。

由Nei's遗传一致性，用非加权配对类平均（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGAM）法进行聚类分析。结果表明，10个居群的大花无柱兰可分为3组，第1组包括布袋山、方岩山、括苍山、兰田、藤岭、天台山、西山和逐步8个居群；第2组仅雁荡山1个居群；第3组仅划岩山1个居群。第1组又可分为4个亚组，其中第1亚组包括布袋山和方岩山，第2亚组包括括苍山和兰田，第3亚组仅为藤岭，第4亚组包括天台山和西山（见图3）。除方岩山外，聚为同一类的居群在地理位置上较近，说明地理分布与亲缘关系的相关性较为显著。

表3 大花无柱兰10个居群的遗传距离与Nei's遗传一致性Table3 Genetic distance and Nei's genetic identity of ten Amitostigma pinguiculum populations

图3 基于遗传一致性的UPGAM聚类图Fig.3 UPGAM dendrogram of Amitostigma pinguiculum based on genetic identity

3 讨 论

我国是一个植物资源丰富的国家，但野生植物的保护没有引起足够的重视，生物多样性正面临严重威胁[10-11]。前人的研究结果表明，特有种或濒危物种的遗传变异水平通常比广布种低[10,12-15]；但近年来有不少报道表明，部分濒危物种或特有种具有较高的遗传多样性水平[12,16-17]。衡量遗传多样性的高低可以用PPB作为指标，其值越大，多样性越高[18]。谢国文等[14]利用ISSR分子标记技术研究永瓣藤（Monimopetalum chinense）的遗传多样性，发现永瓣藤的PPB仅为39.2%，其遗传多样性水平较低；汪小全等[15]发现银杉（Cathaya argyrophylla）的PPB仅为32%，认为银杉濒危的原因之一是低水平的遗传多样性。而刘丹等[17]对中国特有植物鹅掌楸（Liriodendron chinense）进行RAPD分析的结果表明，该物种的PPB高达88.98%，表明其具有较高的遗传多样性，推测濒危的原因是生殖隔离。本研究利用SRAP分子标记技术对10个居群的大花无柱兰进行分析，在物种水平上其PPB为100%，H为0.209 8，I为0.340 2，多样性指数均处于较高水平，表明大花无柱兰具有丰富的遗传多样性。

大花无柱兰居群间的基因分化度（Gst）为0.520 9，远高于多年生草本植物（0.233）、特有种（0.248）和狭域种（0.242），表明大花无柱兰在居群内和居群间均出现了较高水平的遗传分化，其中有52.09%的遗传变异存在于居群间，47.91%的遗传变异存在于居群内，与王静等[19]研究的濒危植物连香树（Cercidiphyllum japonicum）的结果相似。根据估算值的大小，基因流（Nm）分为高、中、低3个水平，而种群间的遗传分化与Nm值呈负相关关系，高水平的基因流可以阻止居群之间的遗传分化[20-21]。大花无柱兰的Nm值为0.459 9，略小于0.5，基因流呈中等水平，可能不足以抵抗居群内因遗传漂变引起的遗传分化，推测有限的基因流可能导致其较高的遗传分化水平。HAMRICK等[22]指出，异交和接触性传粉是植物保持较高遗传多样性的重要原因，大花无柱兰具有较高水平的遗传多样性可能与此有关。大花无柱兰的花朵具备引诱昆虫的特征，在无柱兰属中花型最大，且花色艳丽、形状奇特，推测对传粉昆虫具有较大的吸引力[1]。大花无柱兰具有较高的遗传多样性和遗传变异性，但植株数量很少，除人为采挖外，推测与大花无柱兰对生境变化较为敏感有关。

4 结 论

以珍稀植物大花无柱兰为材料，利用9个引物组合，共获得305条谱带。在物种水平上，多态性比率（PPB）为100%，Nei's基因多样性指数（H）为0.209 8，Shannon's指数（I）为0.340 2；在居群水平上，PPB为24.59%～52.13%，H为0.079 6～0.165 5，I为0.120 9～0.252 3。居群基因分化度（Gst）为0.520 9，基因流（Nm）为0.459 9，遗 传 距 离为0.091 9～0.198 4。大花无柱兰的遗传多样性较为丰富，居群间存在一定的遗传分化和基因交流，可采用就地保护和人工栽培等方式对该物种进行保护。